聚丙烯酰胺(Polyacrylamide, PAM)是丙烯酰胺及其衍生物的均聚物和共聚物的統(tǒng)稱，為線性水溶性高分子的一種，親水性高，能以各種百分比溶于水，不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑。它是應(yīng)用最廣泛的水溶性高分子化合物之一，并享有“百業(yè)助劑”之稱[1]，不僅已廣泛應(yīng)用在石油開(kāi)采、水處理、紡織、造紙、制糖、選礦、醫(yī)藥、 建材、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，而且在食品、藥品以及整容等與人 們?nèi)粘Ｉ詈腿祟惤】迪嚓P(guān)的領(lǐng)域也都有應(yīng)用。

　　

　　在我國(guó)，聚丙烯酰胺的消費(fèi)現(xiàn)狀為：采油工業(yè)是 第一大用戶，占總需求量的80%左右，第二位是水處 理，約占9%,造紙占5%,礦山占2%,其他占3%。在 采油工業(yè)中，聚合物驅(qū)油3次采油技術(shù)已進(jìn)入大面積工業(yè)化推廣應(yīng)用階段[2]。聚合物干粉年注人量已達(dá)萬(wàn) 噸以上，預(yù)計(jì)到2010年，我國(guó)石油開(kāi)采行業(yè)PAM需 求量為10~ll萬(wàn)t，占總需求量的活性污泥80%左右，其規(guī)模 在世界處于遙遙領(lǐng)先地位[3]。伴隨而來(lái)的是大量含有 一定濃度及保留一定黏度的聚合物產(chǎn)出水，大慶油田 有些采油廠采出水中PAM的濃度己經(jīng)高達(dá)l 000 mg ? L-1以上[4]。含聚丙烯酰胺(PAM)污水中殘留單體丙烯 酰胺(AM)的毒性很大[5],如直接排放，將在環(huán)境中逐 漸積累，危害環(huán)境，然而現(xiàn)有工藝無(wú)法滿足處理要求， 需要對(duì)PAM降解的途徑和機(jī)理進(jìn)行全面深入的研 究，尋找合適的處理方法。

　　

　　本文從勝利油田的活性污泥中初步篩選到3株 聚丙烯酰胺降解菌，通過(guò)探索性實(shí)驗(yàn)篩選出適合微生 物降解聚丙烯酰胺的優(yōu)化條件。

　　

　　l材料與方法l.l實(shí)驗(yàn)儀器DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器、SHP-150生化 培養(yǎng)箱、LDZX-50FAS立式電熱壓力蒸汽滅菌器、 YS100顯微鏡、721型分光光度計(jì)、pH計(jì)、紅外光譜儀 (AVATER360FT-IR)、高效液相色譜儀(Agilent1100)。 l.2培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g-L-1):蛋白胨5,牛肉膏l(xiāng)0，NaCi 5。 去離子水1 000 mL。

　　

　　降解培養(yǎng)基(g*L-1):聚丙烯酰胺0.3,葡萄糖2, NaNO31，KH2PO41.5，K2HPO41.5，MgSO4 0.5。去離子水 1 000 mL。

　　

　　1.3菌株的篩選和分離活性污泥中許多微生物接觸一段時(shí)間后才具備 降解抑制物的能力，因此需對(duì)污泥進(jìn)行馴化。將100 mL勝利油田的活性污泥加到盛有1 000 mL的基礎(chǔ)培 養(yǎng)基的燒杯中，置于(35±1)C的恒溫槽中，用魚(yú)缸充 氣器進(jìn)行曝氣。先培養(yǎng)活化3 d后，每72 h更換1次 混合液，逐步增加含聚污水的濃度(聚丙烯酰胺濃度： 50~500 mg.L-1)，培養(yǎng)馴化45 d后進(jìn)行細(xì)菌分離。

　　

　　用平板劃線法分離細(xì)菌，將平板置于37 C的生 化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，再挑取不同形態(tài)的菌落進(jìn) 行平板劃線純化細(xì)菌。根據(jù)菌落形態(tài)和顯微鏡觀察結(jié) 果，重復(fù)劃線分離，直到得到純細(xì)菌。然后再對(duì)篩選出 的菌種進(jìn)行生理生化鑒定。

　　

　　1.4分析方法1.4.1聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度測(cè)定采用濁度法。生物降解率！(％)的表達(dá)式為：!=(C0-Cl)/C0xl00%式中：C0表示降解前的聚丙烯酰胺含量，mg ? L-1 ； C1表 示降解后的聚丙烯酰胺含量，mg*L-1。

　　

　　1.4.2紅外光譜分析聚丙烯酰胺干粉和微生物降解產(chǎn)物，用光譜純 KBr壓片后進(jìn)行紅外光譜分析。

　　

　　1.4.3高效液相色譜分析色譜條件：Agilent ZORBAX XDB-C18 柱(3.0 mm x250 mmx5 !m)；流動(dòng)相為Mili-Q水；流速為0.4 mL.min-1；紫外196 nm處監(jiān)測(cè);進(jìn)樣量為50 !L。此方 法對(duì)丙烯酰胺的檢測(cè)靈敏度為ppb級(jí)[6]。

　　

　　2結(jié)果與討論2.1細(xì)菌的篩選和鑒定從勝利油田的活性污泥中篩選到3株聚丙烯酰 胺好氧降解菌，分別命名為AS-l、AS-2和AS-3。根 據(jù)形態(tài)觀察和生理生化鑒定，初步鑒定為：AS-l為脂 肪桿菌屬，AS-2為海球菌屬，AS-3為動(dòng)性球菌屬。

　　

　　2.2細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線了解其生長(zhǎng)繁殖規(guī)律，這對(duì)有 效地利用和控制細(xì)菌的生長(zhǎng)具有重要的意義。在適宜 的條件下，培養(yǎng)細(xì)菌要經(jīng)歷延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和 衰亡期4個(gè)階段。

　　

　　采用濁度法分別測(cè)定了 AS-l、AS-2和AS-3以 及混合菌在降解培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。 從圖中可以看出，3株菌和混合菌在前5 h內(nèi)生長(zhǎng)緩 慢，處于生長(zhǎng)的延遲期。5 h后細(xì)菌濃度大大增加，開(kāi) 始進(jìn)入細(xì)菌的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。11 h后，細(xì)菌的生長(zhǎng)又開(kāi) 始趨向平緩，這時(shí)進(jìn)人了穩(wěn)定期，持續(xù)一定時(shí)間后，細(xì) 菌濃度開(kāi)始減少，進(jìn)人衰亡期。其中菌株AS-2的生長(zhǎng)較快，細(xì)菌濃度較大，是優(yōu)勢(shì)菌種。

　　

　　2.3單株菌和混合菌的降解能力比較環(huán)境污染物的降解有時(shí)可通過(guò)單株細(xì)菌完成，有 時(shí)也需要多株細(xì)菌間的協(xié)作來(lái)完成的。同時(shí)多株菌共 存可能存在協(xié)同作用，提高單株菌對(duì)降解物的降解效 果，也可能存在拮抗作用，降低單株菌對(duì)降解物的降 解效果。所以，將3株菌正交混合后在降解培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，考察對(duì)聚丙烯酰胺的降解效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。 6.5、7、7.5、8、8.5、9。在 35 "，140r.min-1 的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)5 d后測(cè)定聚丙烯酰胺的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)圖4。

　　

　　從圖4可以看出，不同的初始pH值對(duì)聚丙烯酰 胺的降解有較大的影響。pH值在7#8之間時(shí)，聚丙烯 酰胺的降解效果較好。降低或增大pH值，聚丙烯酰 胺的降解率都減小。當(dāng)pH=8時(shí)，聚丙烯酰胺的降解 率最高，達(dá)到33.29%。

　　

　　o 53 20 5 0 52 '—i '—_%/MVd iocoCOPBJl——(BAOln9y0 AS-1 AS-2 AS-3 AS-1,2 AS-1,3 AS-2,3 AS-1,2,3 Different combinations of bacterium圖2單株菌和混合菌的降解能力的比較 Figure 2 The comparison of degradation rates of singIe bacterium and mixed bacteria不同菌株對(duì)聚丙烯酰胺的降解能力存在差異，菌 株AS-2的降解效果最好，菌AS-1和AS-3對(duì)聚丙烯 酰胺的降解效果不明顯，并且菌AS-1和AS-3對(duì)菌 AS-2有明顯的拮抗作用?；旌吓囵B(yǎng)的降解效果都不如 單株菌AS-2的降解效果。所以菌AS-2為降解聚丙烯 酰胺的優(yōu)勢(shì)菌，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中對(duì)其作深人研究。

　　

　　2.4菌AS-2降解聚丙烯酰胺的條件優(yōu)化 2.4.1最佳反應(yīng)時(shí)間的確定將菌AS-2接人250mL的降解培養(yǎng)基中，在37 "，140 ?min-1的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)，間隔一定的 時(shí)間測(cè)定聚丙烯酰胺的濃度。

　　

　　從圖3可以看出，在前5 d內(nèi)，菌AS-2對(duì)聚丙烯 酰胺的降解效果明顯，在第5 d的時(shí)候，聚丙烯酰胺 的降解率達(dá)到40.51%。而后，隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)， 聚丙烯酰胺降解率增長(zhǎng)緩慢。這可能是菌AS-2的代 謝產(chǎn)物所致。由于過(guò)長(zhǎng)的降解時(shí)間不但增加處理成 本，而且不利于實(shí)際應(yīng)用。所以，選取菌AS-2降解聚 丙烯酰胺的最佳時(shí)間為5 d。

　　

　　2.4.2初始pH的確定不同的微生物有其最適宜的生長(zhǎng)pH值范圍，同 一微生物在其不同的生長(zhǎng)階段和不同的生理、生化過(guò) 程中，也要求不同的最適宜的pH值。將菌AS-2接人 降解培養(yǎng)基中，分別將pH值調(diào)為2、3、4、5、5.5、6、2.4.3溫度的確定將菌AS-2接人降解培養(yǎng)基中，溫度范圍為25# 55 "，pH=8,靜置培養(yǎng)4 d后測(cè)定聚丙烯酰胺的濃 度。 溫度對(duì)聚丙烯酰胺降解率的影響見(jiàn)圖 5。 當(dāng)溫度 為30#45 "時(shí)，AS-2對(duì)聚丙烯酰胺的降解效果較好， 在40 "時(shí)，聚丙烯酰胺的降解效果達(dá)到最好，降解率 達(dá)到32.25%。繼續(xù)升高溫度，聚丙烯酰胺的降解率大 幅度下降。所以，40"為最佳降解溫度。

　　

　　2.4.4最佳碳源的確定分別選取了 NaHCO3、乙酸鈉、橄欖油、可溶性淀 粉、原油、葡萄糖、蔗糖為碳源，其含量均為2 g*L-1，25303540455055T emperature/C圖5溫度對(duì)降解率的影響 Figure 5 The effect of temperature on degradation ratespH為8，在37 C，140 r.min-1的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng) 5 d后測(cè)定聚丙烯酰胺的含量。從圖6可以看出，碳源 為葡萄糖時(shí)，菌AS-2對(duì)聚丙烯酰胺的降解效果最 好，降解率達(dá)到40.73%，碳源為原油時(shí)，降解率較低， 為29.70%。但油田的含聚污水中同時(shí)也含有原油，所 以從實(shí)際應(yīng)用考慮，選取原油為碳源。

　　

　　2.4.5最佳氮源的選擇分別選取了 NaNO;、尿素、硫酸銨、蛋白胨、NH4CI 為碳源，其含量均為lg.L-l，pH為8,在37C、140r. min-1的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)5d后測(cè)定聚丙烯酰胺的 含量。從圖7可以看出，氮源為NaN〇3時(shí)，菌AS-2對(duì) 聚丙烯酰胺的降解效果最好，降解率達(dá)到43.75%。 2.4.6碳源、氮源含量的確定分別考察了原油和硝酸鈉含量對(duì)菌AS-2降解 聚丙烯酰胺的影響(結(jié)果見(jiàn)圖8，圖9)。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng) 原油含量為2.5 g-L-1，硝酸鈉含量為1.4 g-L-1時(shí)，菌 AS-2對(duì)聚丙烯酰胺的降解效果最好，分別達(dá)到了 33.83%和 45.23%。

　　

　　050505054 3 3 2 2 1 1%/svd-M-loco!=:OPB!-ll——(扣 Aom€y-5 0 5 0 5 0 53 3 2 2 1 1%/sVJ jo SU0P2 PAOiy0L0.5l.01.52.02.53.03.54.0Crude oil content/g ? L-1圖8碳源含量對(duì)降解率的影響Figure 8 The effect of crude oiI content on degradation rates_L_Jq_L_lo9pmo^ EOO^EUItc,u itlo:}!?Iffe I D_l_IoJ。

　　

　　-vL-sUBSBJq'ce!

　　

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　　_J_J€soonTb圖6碳源種類對(duì)降解率的影響Figure 6 The effect of different carbon sourced on degradation rates00004 3 2 1%/sv J JO SLI0--32 PAOS9y000005 4 3 2 1%/sVJ JO SU0P2 PAOiK00.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0NaN〇3 content/g ? L-1圖9氮源含量對(duì)聚丙烯酰胺的影響 Figure 9 The effect of NaN〇3 content on degradation rates^3l——(q031?

　　

　　D5J.N:9U0-I_ld9dces lr( 5s015 Itrc8VH53nt圖7氮源種類對(duì)降解率的影響Figure 7 The effect of different nitrogen sources on degradation rates3囷AS-2對(duì)聚丙烯酰胺結(jié)構(gòu)的影響分別對(duì)聚丙烯酰胺降解前后的樣品進(jìn)行了紅外 掃描（圖10、圖11)。從圖中可以看出，經(jīng)過(guò)菌AS-2 降解后的聚丙烯酰胺的紅外光譜圖發(fā)生了明顯的變 化。降解后聚丙烯酰胺的譜圖中的3 300~3 500 cm-1 處附近-NH2的伸縮性振動(dòng)特征吸收峰明顯變?nèi)?，說(shuō) 明了微生物主要降解了聚丙烯酰胺側(cè)鏈上的酰胺基。 根據(jù)1 364 cm-1和920 cm-1附近出現(xiàn)新的吸收峰，可mAU8006004002000rvuocyU寸。：PZL 66S-I—I)()

　　

　　5012345678圖11丙烯酰胺標(biāo)樣的高效液相色譜圖Figure 11 The HPLC picture of AM standard sample以確定體系中的羧基的存在。1 462 cm-1處的峰消失和 1082 cm-1處的峰明顯變寬變強(qiáng)，說(shuō)明氨基可能從聚 丙烯酰胺側(cè)鏈上脫落下來(lái)成為游離的氨基。同時(shí)， 530"995 cm-1處出現(xiàn)的幾個(gè)強(qiáng)的吸收峰代表了芳香 化合物，可能是微生物的代謝產(chǎn)物。所以，可以推斷菌 AS-2主要降解了聚丙烯酰胺的側(cè)鏈，把酰胺基降解 成了羧酸和游離的氨基。

　　

　　4丙烯酰胺單體的測(cè)定聚丙烯酰胺本身基本無(wú)毒，但是它的單體，丙烯 酰胺(Acrylamide，AM)的毒性卻很強(qiáng)，它是神經(jīng)系統(tǒng)致毒劑，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有損傷作用，中毒后表現(xiàn)為肌體 無(wú)力和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀[7]。因此，在PAM的使用過(guò)程 中人們非常關(guān)注是否有單體釋放出來(lái)。本文用高效液 相色譜法考察了生化過(guò)程中是否有丙烯酰胺單體產(chǎn) 生（圖11、圖12)。

　　

　　從圖中可以看出，丙烯酰胺標(biāo)樣的保留時(shí)間為 3.227 min，而降解后的PAM溶液的3個(gè)峰的保留時(shí) 間分別為1.902、2.715、2.929 min，均不在丙烯酰胺出 峰處。說(shuō)明經(jīng)生化處理后的PAM溶液中沒(méi)有丙烯酰 胺單體生成。用高效液相色譜檢測(cè)生化后的PAM溶 液，未檢測(cè)出單體丙烯酰胺。

　　

　　mAU500400 -30020010000圖12生化后PAM溶液的局效液相色譜圖 Figure 12 The HPLC picture of PAM after biodegradation5結(jié)論(1)從勝利油田的活性污泥中篩選出3株聚丙烯 酰胺降解菌，通過(guò)比較篩選出一株降解效果較好的菌 AS-2。研究了 AS-2對(duì)聚丙烯酰胺生物降解的最佳條 件。結(jié)果表明，當(dāng)降解時(shí)間為5 d、pH=8、溫度為40 #、碳源為原油、氮源為NaNO;、原油和NaNO3的含量 分別為2.5、1.4 g，L-1時(shí)，AS-2對(duì)聚丙烯酰胺的降解 率達(dá)到45.23%。

　　

　　(2)分別對(duì)聚丙烯酰胺降解前后的樣品進(jìn)行了紅 外掃描。經(jīng)過(guò)菌AS-2降解后的聚丙烯酰胺的紅外光 譜圖發(fā)生了明顯的變化。經(jīng)過(guò)紅外分析，可以推斷菌 AS-2主要降解了聚丙烯酰胺的側(cè)鏈，把酰胺基降解 成了羧酸和游離的氨基。結(jié)果表明，菌AS-2對(duì)聚丙 烯酰胺具有較強(qiáng)的生物降解功能。用高效液相色譜檢 測(cè)生化后的PAM溶液，未檢測(cè)出單體丙烯酰胺。