目前臨床上能影響血中LDL水平 類，一類是與遺傳有關(guān)的原發(fā)性因素， 蛋白血癥；另一類是因其它疾病引起& 繼發(fā)因素而致的LDL升高應(yīng)以治療H 原發(fā)因素所致的LDL升高則通過降,

l引言

尚脂血癥尤其是低密度脂蛋白（Low density lipoprotein, LDL)導(dǎo)致動脈粥樣硬化是公認的事實 ，由此而引起的心、腦血管疾病嚴重危害人類的健 

進行控制，但效果并不滿意。70年代以來，去除LDL 的血液凈化療法逐漸應(yīng)用于臨床，其中的吸附劑吸 附法由于對LDL具有選擇性吸附，所以取得了較好 的療效。制備LDL吸附劑首先涉及的一個重要環(huán)節(jié) 就是吸附劑載體的選擇和合成。它的性質(zhì)能影響吸 附劑在吸附選擇性以外的其它性能。一般來說，應(yīng)用 于血漿的特異吸附劑載體必須具備如下性質(zhì)：（1)滅 菌后其結(jié)構(gòu)及化學(xué)性質(zhì)不變或變化很小;（2)高黏稠 流體血漿的快速流動不引起聚集;（3)載體本身對血 漿成分的非特異性吸附很少;（4)由于機械作用原因 吸附劑載體破碎后不脫落出微粒;（5)要有足夠的吸 附面積;（6)必需有優(yōu)良的血液相容性。根據(jù)前述要 求，本文采用反相懸浮聚合法合成具有一定粒徑和 孔徑的聚丙烯酰胺微球作為載體，以絲氨酰-天冬氨 酰#氨酸（SDE)負電性三肽（此三肽廣泛存在于 LDL受體配體結(jié)合域7個重復(fù)序列的羧基末端，對 LDL受體特異性識別LDL起著重要作用[1'2])作為 配體固定于其上制成LDL親和吸附劑，并初步研宄 了此吸附劑吸附LDL的性能。

2材料和方法

2.1實驗試劑與儀器

丙烯酰胺(AAM)，AR,天津市化學(xué)試劑研宄 所;亞甲基雙丙烯酰胺(MBA), BR,中國科龍

精細化工廠；過硫酸鉀（KPS), AR，西安化學(xué)試劑 廠；四甲基乙二胺(TEMED),生化試劑，中國上海 前進化學(xué)試劑廠；司本~80( Span~80)，上海市申隆制 藥廠；吐溫~80(Tween~80)，上海市申隆制藥廠；甲 苯（Methylbenzene), AR,中國成都金山化工試劑 廠；氣苯(Chlorobenzene)，AR,中國上海試劑一■廠； 戊二醛，AR,天津市華真特種化學(xué)試劑廠；1-乙基- 3~( 3-二甲基氨丙基)泰二亞胺(EDC), BR, ACR0S Oganics公司；SDE三肽，本實驗室合成。懸浮聚合 反應(yīng)釜，本實驗室自備；圖像分析儀，中國科學(xué)院;X 射線衍射儀,PW1700, KRATKY狹縫系統(tǒng)，菲利浦 公司；日立牌X~650型掃描電鏡;THZ~82恒溫振蕩 器，常州國華電器有限公司；自動生化檢測儀，日本 島津。

2. 2微球的制備及其粒徑和單分散指數(shù)的測定

將溶有司本~80和吐溫~80的甲苯和氯苯混合 物(；油相)加入懸浮聚合反應(yīng)II中，保持60 °C的反應(yīng) 溫度，緩慢攪拌使加熱均勻，并通入氮氣5 min。將 引發(fā)劑溶液加進溶有AAM和MBA的水相中，并 加催化劑預(yù)引發(fā)反應(yīng)2 min,然后將其立即加入至 60°C的反應(yīng)釜中，調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速為200?300 rpm， 繼續(xù)用氮氣保護聚合反應(yīng)。2 h后停止反應(yīng)，產(chǎn)物用 蒸餾水反復(fù)沖洗并置于蒸餾水中備用。聚合體系的 配方見表1。 

表1聚合體系的配方

Table 1 The composition of reversed-phase suspension polymerization system

Water phaseOil phaseDispersion[systemInitiate agent

AAMMBAH2OM ethylbenzene ChlorobenzeneSpan 80Tween 80KPSTEMED

(g)(g)(g)(ml)(ml)(g)(g)(G)(drop)

9. 1611.06675112. f) 112.51. 350.450. 04093

(18.4 ： 1)

Numerical ratio in the bracket is the mole ratio of AMM and MBA

 

將微球點樣至電鏡樣品臺上，自然干燥,表面噴 金，用掃描電鏡作形貌分析。將微球樣品在載玻片上 制樣，送至圖像分析室，選取500粒以上的樣品微球 作統(tǒng)計分析，返回統(tǒng)計樣本的粒徑數(shù)據(jù)集合，得到樣 本的平均粒徑(7))和單分散指數(shù)(MDI)。MDI按下 式求得[3]:

U^ kLDi /( ZDl • LL»|

i= 1i= 1i= 1

式中：k為樣品中粒子總數(shù);D,代表被測微球的粒 徑。最后用粒徑分布直方圖進一步表示樣本的粒徑 特征。

2.3不同交聯(lián)度微球的制備及其孔徑的測定

以2. 2節(jié)方法按表2的配方進行不同交聯(lián)度微 球的制備。

用X光小角散射法測定各合成樣品的孔徑。 2.4 LDL吸附劑的制備及其吸附性能的測定

參閱文獻[4]。

3結(jié)果

按表1配方合成的微球，其形貌率 圖la可知合成樣品微球之間分得很于 勻，很少有粘連的情況。圖lb顯示樣 的球形。微球的平均粒徑為111.S 1. 12,粒徑分布直方圖見圖2。常將IV 

表2不同交聯(lián)度聚合體系的配方

Table 2 The composition of reversed^phase suspension polymerization system with various degrees of crosslinking

Water phaseOil phaseDispersion systemInitiate agent

Experiment

No.AAM

(g)MBA

(g)H2〇

(g)Methyl benzene (ml)Chioro benzene (ml)Span 80 (g)Tween 80 (g)KPS

(g)TEMED (drop)

A8. 3761. 851 (9. 8： 1)75112. 5112. 51. 350.450. 04093

B9. 1611.066 (18.4 ： 1)75112. 5112.51.350.450. 04093

C9.5030. 724 (26. 8 : 1)75112. 5112. 51.350.450. 04093

D9.7860.441 (46. 0 : 1)75112. 5112.51.350.450. 04093

* Numerical ratioin the bracket isthe mole ratio of AAMand MBA

圖1聚丙烯酰胺微球電鏡形貌圖(a放大200倍,b放大1000倍）

Fig 1 The SEM morphology of polyacrylamide beads( la X 200, lbX 1000) 

為粒子單分散的標志|3]，由此可知本實驗一次成球 未達到粒子單分散的要求；同時樣品的粒徑分布直 方圖也證實了這點,其柱形分布圖寬而低。為此，嘗 試使用了篩分的方法。在水流的作用下對樣品用標 準分樣篩進行篩分，結(jié)果表明大部分微珠在80? 120目與120?180目之間，對篩分所得的兩組樣品 用圖像分析儀統(tǒng)計粒徑，結(jié)果見圖3。篩分后兩個級 分的粒徑和單分散指數(shù)見表3。從圖3和表3可知, 篩分后兩個級分均達到粒子單分散的要求，按要求 (具體見討論)我們選擇平均粒徑為142. 1 pm的級 分作為吸附劑載體。

表3樣品的篩分結(jié)果

Table 3 The sieving result of sample polyacrviamiH^

Fraction

l(80-120mesh)87. 1

2( 120-180mesh)142. 1

用X光小角散射法測得的不同交聯(lián)I 如表4。

表4 X光小角散射法測得的不同交聯(lián)度微球的孔徑 Table 4 The pore diameter of polyacrylamide bead with various

degrees of crosslinking determined by small angle X^ay scattering

SampleA(1 ： 10)B(1 ： 18)C( 1 ： 27)D( 1 ： 46)

R( nm)67. 5119. 8129.5144. 3

為了觀察不同交聯(lián)度對聚丙烯酰胺微球表面孔 徑的影響，本實驗根據(jù)表4做圖并擬合得到了交聯(lián) 度與聚丙烯酰胺微球表面孔徑的關(guān)系(見圖4)。

在圖4中用A至D四點擬合可得一直線，由以 下方程表示：

167. 87- 987. 5SX(X< 0. 1)(1) 

 

圖3樣品篩分后的粒徑分布圖

Fig 3 Histograms of polyacrylamide bead distribution of sieved polyacrylamide bead

Fraction 1: 80-120mesh； Fraction 2: 120-180mesh 

以本實驗合成的具有一定粒徑和孔徑的聚丙烯 酰胺微球為載體，以絲氨酰-天冬氨酰I氨酸 (SDE)負電性三肽為配體固定于其上制成LDL親 和吸附劑，其對LDL和高密度脂蛋白（HDL)的吸 附性能如圖5所示。

Adsorbent

圖5兩種吸附劑對LDL和HDL的吸附率^±s, n= 4)

A代表聚丙烯酰胺微球;B代表用戊二酸法制備的吸附劑；C代表用 EDC法制備的吸附劑

Fig 5 The adsorption rate of two adsorbents for LDL and HDL

(x±s，4)

A: polyacrylamide bead; B adsorbent: ligands a BGP100 by glutaraldehyde； C adsorbent： ligands BGP100 by EDC

4討論

如前所述，吸附劑載體的性質(zhì)能丨 吸附選擇性以外的其它性能，因此應(yīng)：

行選定。本研宄選擇聚丙烯酰胺微球作為載體是基 于其以下特點：不含生物多聚體，因而不易滋生微生 物；具有相對較好的pH穩(wěn)定性(PH2-10)和化學(xué)穩(wěn) 定性;具有的酰氨基在溫和反應(yīng)條件下易于接上各 種類型的臂和/或配體[5];利用交聯(lián)度和/或共聚方 法，聚丙烯酰胺微球的孔徑、彈性和填柱的透過率可 按需要進行調(diào)節(jié)；由于丙烯酰胺共聚物微球的彈性 和疏水性可調(diào)，因而吸附LDL的強度遠遠大于吸附 其他的血漿蛋白[6];具有較好的親水性、優(yōu)良的生物 相容性和很小的非特異性吸附[7];在121 °C蒸汽或 2. 5 Mrad下消毒不失去其原有功能[7];大孔徑聚丙 烯酰胺微球有足夠的吸附面積用于去除血中的 LDL。

本實驗合成聚丙烯酰胺微球的最終粒徑為 142. 1 A/m,孔徑為119. 8 nm，這樣的結(jié)構(gòu)使其無論 應(yīng)用于血漿還是全血均有較好的血液相容性，且有 足夠的LDL吸附面積。因為微球孔徑在100?200 nm范圍內(nèi)時,LDL可擴散通過微孔進入微球內(nèi)部， 致LDL的吸附面積大大增加；而粒徑比LDL大的 成分如血細胞等卻被排除在微球之外，使血細胞等 成分與吸附材料的相互作用減少，材料獲得較好的 血液相容性[8'9]。

由圖4和擬合公式（1)可知，在MBA與A AM 總量一定和MBA與AAM摩爾比小于0. 1的條件 下，隨著MBA與A AM摩爾比的減小，微球的孔徑 逐漸增大，也即MBA的用量越小，微球孔徑越大。 這是由于交聯(lián)劑用量增大時，微球內(nèi)交聯(lián)點距變窄， 網(wǎng)絡(luò)空間變小，交聯(lián)密度增加，因而微球孔徑變小。 公式（為以后用類似方法合成聚丙烯酰胺微球，更 好地調(diào)控其孔徑以適應(yīng)作為LDL吸附劑載體的需 要提供了有益的理論依據(jù)。

通過對合成的聚丙烯酰胺微球氨乙基化、肼解、 堿水解等相應(yīng)的處理后，再以戊二醛或1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)泰二亞胺為偶聯(lián)劑，輔以氰基硼 氫鈉催化（以戊二醛為偶聯(lián)劑時用），就可在很溫和 的條件下接上適當?shù)乃鸥舯?rdquo;和配體(SDE)。這不 僅對制備LDL吸附劑十分有利，而且對在其上固定 其他配體從而制備相應(yīng)的吸附劑同樣很有效。

從圖5我們可以看出，無論被測血漿中是否存 在高濃度的Ca2+，未偶聯(lián)配體的聚丙烯酰胺微球?qū)?LDL及HDL的吸附很少，而當固定上SDE酉己體制 成吸附劑后（無論是B吸附劑還是C吸附劑）其對

LDL的吸附率明顯增高，與聚丙烯酰胺微球相比，P <0.05。此現(xiàn)象一方面說明本實驗合成的聚丙烯酰 胺微球非特異性吸附很小，另一方面也說明本聚丙 烯酰胺微球作為LDL特異性吸附劑的載體是有效 的。

本實驗采用反相懸浮聚合法合成了具有一定粒 徑和孔徑的聚丙烯酰胺微球，并對相應(yīng)工藝進行了 探討；同時在微球上固定SDE配體制成LDL吸附 劑，對此吸附劑吸附LDL性能進行了初步研究。本 微球雖然基本上符合作為LDL吸附劑載體的需要， 但仍有一定的缺點，如其強度不夠，在體外制成吸附 柱進行實驗時有可能引起聚集，這些需在以后實驗 中加以改進。