部分水解聚丙稀酰胺（partially hydrolyzed polyacrylamide，HPAM)以其良好的絮凝性被廣泛 用來(lái)提高原油的釆收率[1],聚丙烯酰胺注入地下 后，少部分隨原油被采出，而大部分存在于油層中，隨原油吸附在土壤及巖石表面，導(dǎo)致油井周 圍的土壤中含有大量的聚丙烯酰胺和原油，給環(huán) 境帶來(lái)危害[2]。微生物降解以其特有的無(wú)害化處理 將成為解決聚丙烯酰胺引起環(huán)境污染潛在毒性的 有效手段[3]。然而，游離微生物在處理含聚污水的 過(guò)程中菌體易流失，且污水中的一些有害物質(zhì)會(huì) 對(duì)微生物產(chǎn)生毒害作用[4]。而微生物固定化技術(shù)可 以減輕或消除菌體的流失，并且使微生物保持活 性，可反復(fù)使用，固定化后微生物對(duì)有毒物質(zhì)的 承受能力及對(duì)有機(jī)物的降解能力都有明顯的提 高[5]。因此微生物固定化技術(shù)成為生物及環(huán)境領(lǐng)域 的研宄熱點(diǎn)[6]。目前，微生物固定化的制備方法可 分為吸附法、共價(jià)法、包埋法和交聯(lián)法4種[7]。
作者采用微生物固定化方法處理聚丙烯酰胺污 染和石油污染的土壤，從污染土壤中篩選出聚丙 烯酰胺和原油高效降解菌，篩選出的菌株既可以 以聚丙烯酰胺作為唯一氮源又可作為唯一作為碳 源被利用，解決了之前研宄中聚丙烯酰胺只能作 為微生物繁殖的氮源不能作為碳源的缺陷。并且 選擇包埋固定化方法處理聚丙烯酰胺污染土壤。
1實(shí)驗(yàn)材料
1.1土壤樣品
實(shí)驗(yàn)用土壤采自大慶油田采油四廠的一口聚丙 烯酰胺與原油污染的井場(chǎng)，在離地表約5?20cm處 取樣，將取得的樣品裝入己經(jīng)滅菌的樣品袋中， 密封。過(guò)40目篩，樣品放置于冰箱中4°C保存。
1.2培養(yǎng)基
(1)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L): K2HPCV3H20 1.0, NH4NO3 1.0 , KH2PO4 1.0，CaCl2 0.02， MgS04,7H20 0.5，F(xiàn)eCl3 痕量。
(2)分離、純化培養(yǎng)基(g/L):向上述（1)的 培養(yǎng)基中加入HPAM 0.5,瓊脂1.5%?2.0%，調(diào)節(jié) pH值至7.2。
(3)活化培養(yǎng)基(g/L): HPAM0.5, NaC10.5， 蛋白胨 6.0,尿素 9.0，KH2P〇4〇.5, MgSO40.5。
(4)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):向上述（1)的培養(yǎng)基 中加入HPAM0.5,調(diào)節(jié)pH=7.0。
(5)菌種保藏斜面培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng) 基（細(xì)菌）和馬丁氏培養(yǎng)基（真菌）。
2實(shí)驗(yàn)方法
2.1菌種篩選與鑒定
(1)菌種篩選將10 g聚丙烯酰胺污染的土 壤樣品加入到含聚丙烯酰胺100 mg/L，葡萄糖500 mg/L的上述1.2節(jié)（1)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，HZQ- X100立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱，120r/min，35 °C下培 養(yǎng)，待培養(yǎng)液變渾濁，吸取5 mL培養(yǎng)液，將移取 的液體加到含聚丙烯酰胺300 mg/L,葡萄糖 300 mg/L的培養(yǎng)基中放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱繼續(xù)培 養(yǎng)，重復(fù)上述過(guò)程直到細(xì)菌在含聚丙烯酰胺 500 mg/L,葡萄糖濃度為0 mg/L的培養(yǎng)基中能生 長(zhǎng)為止。制作上述1.2節(jié)（2)的分離、純化培養(yǎng) 基，接種環(huán)挑取微生物培養(yǎng)液在培養(yǎng)基上劃線， 劃線之后將培養(yǎng)基放入溫度為35 °C，轉(zhuǎn)速為120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，通過(guò) 電鏡觀察菌株是否純化。
(2)菌種鑒定微生物菌株的形態(tài)觀察與生理 生化反應(yīng)參照常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[8]與伯杰氏細(xì) 菌鑒定手冊(cè)。將菌株初步鑒定到屬。
2.2測(cè)定方法
(1)聚丙烯酰胺降解率的測(cè)定：采用淀粉-碘 化鎘比色法測(cè)定聚丙烯酰胺的濃度。
(2)土壤原油含量的測(cè)定：分光光度法[9]。
23菌體生物量的測(cè)定
采用722型可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定溶液的0£>66〇 值（光密度）來(lái)表示生物生長(zhǎng)量的多少，〇£>值是 物質(zhì)在溶液中吸收特定波長(zhǎng)光線強(qiáng)弱的參數(shù)。在 波長(zhǎng)為660 nm處對(duì)含聚丙烯酰胺的微生物培養(yǎng)液 進(jìn)行光密度的測(cè)量，光密度值與菌群菌數(shù)成正 比。將單菌以3%的體積比接入1.2節(jié)（4)的基礎(chǔ) 培養(yǎng)基中，在35 °C、120 r/min條件下放入振蕩培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以蒸餾水作為空白對(duì)照進(jìn)行測(cè)定， 以此作為微生物菌群生長(zhǎng)曲線的參考指標(biāo)。
2.4單一菌種與混合菌降解聚丙烯釀胺和原油的 效果比較
將活化后的單一菌種與4種單菌Rl，R2, R3, Y3的混合菌按照3%的總體積分?jǐn)?shù)分別加入上 述1.2節(jié)（4)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于35 °C、120 r/min 條件下放入振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后測(cè)HPAM與 原油的去除率，比較單一菌種與混合菌種對(duì) HPAM和原油的降解效果。
2.5微生物固定化顆粒的制備
(1)制備濕菌體將篩選出四種單菌的混合菌 作為固定化的菌體，將菌株依次接入200 mL的1.2 節(jié)（3)所示的活化培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)4次連續(xù)活化。 取活化后的培養(yǎng)液2 mL加入到200 mL的富集培養(yǎng) 基中培養(yǎng)2?3天，富集培養(yǎng)基經(jīng)離心機(jī)離心，得
到濕菌體。
(2)包埋法固定化顆粒的制備4種固定化方 法中包埋固定化法以其操作簡(jiǎn)單，對(duì)微生物活性 影響小，制作的固定化微生物小球的強(qiáng)度高等優(yōu) 點(diǎn)優(yōu)于其它3種固定化方法，所以本實(shí)驗(yàn)采用包埋 法。以蒸餾水配置一定濃度的包埋載體溶液，加 入一定量的濕菌體，用5 mL注射器吸取載體溶 液，將載體溶液滴入一定濃度的交聯(lián)劑中，交聯(lián) 一定時(shí)間，將固定化顆粒放入200 mL的1.2節(jié)(4) 所不的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，35 °C，120r/min振蕩培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)降解聚丙烯酰胺。
(3)5種包埋固定化制備方法采用5種包埋 法進(jìn)行微生物的固定化，5種包埋固定化法制備微 生物固定化顆粒的條件如表1所示。
按照表1中的制備條件制備固定化顆粒，比較 5種包埋法制備微生物固定化顆粒的難易程度、小 球強(qiáng)度和初性以及制備費(fèi)用，從中選擇一種制備 費(fèi)用低廉、制備容易、強(qiáng)度和初性都較好的包埋 方法。
2.6微生物固定化顆粒降解HPAM和原油的效果
以固定化顆粒對(duì)聚丙烯酰胺的降解率與對(duì)原油 的去除率來(lái)比較幾種包埋固定化方法。按照表1中 的5種包埋固定化制備方法，制作固定化顆粒，各 稱取10 mL載體與濕菌體的混合物制得的固定化顆 粒，分別放入200 mL的1.2節(jié)（4)所示的基礎(chǔ)培 養(yǎng)基中，在35 °C, 120 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 天，測(cè)聚丙烯酰胺的降解率。
2.7微生物固定化處理采油污水污染土壤
取大慶油田采油四廠的一口井場(chǎng)取回的聚丙烯 酰胺與原油污染土壤，先除去其中的磚塊、瓦礫 等雜物后自然風(fēng)干，再將土樣過(guò)40目篩，得到顆 粒大小均勻的土樣，將土壤樣品加入到1.2節(jié)（1) 所示的200 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，測(cè)得培養(yǎng)基中聚丙 烯酰胺濃度為500 mg/L,原油濃度為733.21 mg/L。取10 mL PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的 載體與濕菌體的混合物制得的固定化顆粒放入上 述培養(yǎng)基中，在35 °C，120 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，每3天測(cè)聚丙烯酰胺的降解率，并采用分光光 度法測(cè)原油含量。
3結(jié)果與討論
3.1菌種篩選結(jié)果
經(jīng)分離純化得到4株對(duì)聚丙烯酰胺有降解效果 的菌種，即Rl、R2、R3、Y3。菌落圖片和菌株電 鏡掃描圖片如圖1所示。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手 冊(cè)》及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，可以初步鑒定： R1為芽孢乳桿菌屬，R2為微球菌屬，R3、Y3為 假單胞菌屬菌株。
3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
以HPAM標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，可見(jiàn)分光 光度計(jì)測(cè)得的〇/)42〇值為縱坐標(biāo)繪制的HPAM濃 度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線的線性回歸方程為 y=0.0386jc+0.0019，/?2=0.9995。測(cè)定待測(cè)溶液吸光 度值，即可從線性回歸方程計(jì)算出待測(cè)溶液的實(shí) 際HPAM濃度。
33單菌生物量的測(cè)定
以〇乃66()值代表細(xì)菌的生物量，菌體生長(zhǎng)量越 多，培養(yǎng)基越渾濁，〇/?66()值越大。因此，OD66f) 值越大。表示菌體生物量越多。微生物生長(zhǎng)曲線 如圖2所示。
如圖2所示，微生物的生長(zhǎng)曲線反映一種微生 物在一定生活環(huán)境中的生長(zhǎng)繁殖和死亡規(guī)律。由 圖2的生長(zhǎng)曲線可以看出，4種菌體在含500 mg/L 聚丙烯酰胺的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，菌體經(jīng)歷了停
表1 5種包埋法制備微生物固定化顆粒的條件
包埋方法包埋劑/g蒸餾水
/mL濕菌購(gòu)載 體質(zhì)量比交聯(lián)劑交聯(lián)時(shí)間
海藻酸鈉+活性炭粉海藻酸鈉2,活性炭0.5481:24% 的 CaCl224 h
海藻酸鈉包埋與戊二醛交聯(lián)結(jié)合海藻酸鈉2,活性炭0.5481:24%的CaCl21.0%的戊二醛戊二醛交聯(lián)1?2天
PVA+海藻酸鉆+添加劑PVA10,海藻酸鈉1901:22%的CaCl2飽和硼酸溶液CaCl2與飽和硼酸共同交聯(lián)24 h
Si〇2 3, CaC〇3〇.3
PVA冷凍PVA4,海藻酸鈉1451:24% 的 CaCl2于冰箱冷凍室在-i5 °c下冷凍過(guò)夜，
再在室溫下解凍，重復(fù)冷凍解凍4次
明膠一戊二醛明膠201001:21.0%的戊二醛戊二醛交聯(lián)2天
高于4種單菌，混合菌對(duì)HPAM的降解率在第3 天基本保持穩(wěn)定，達(dá)到55%以上，對(duì)原油的去除率 可達(dá)到75%以上。這可能是由于單一菌種不具備一 整套完整的酶系統(tǒng)或基因成分降解這些不易降解 的有機(jī)物，而微生物群落中不同基因的擁有者卻 可能發(fā)生基因交換或重組，從而導(dǎo)致新的降解途 徑的實(shí)現(xiàn)。
3.5微生物固定化
(1)5種包埋方法比較對(duì)5種包埋法的制備 難易程度、固定化后小球的強(qiáng)度和軔性及制作成 本進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表2所示，海藻酸鈉包埋與戊 二醛交聯(lián)結(jié)合法與明膠-戊二醛法這兩種方法制作 費(fèi)用高，且明膠-戊二醛法操作較困難，制成的固 定化顆粒形狀不規(guī)則，海藻酸鈉包埋與戊二醛交 聯(lián)結(jié)合法制備的小球初性、強(qiáng)度一般。因此排除 海藻酸鈉包埋與戊二醛交聯(lián)結(jié)合法與明膠一戊二 醛法這兩種方法，選用其余3種制備費(fèi)用低廉的方 法測(cè)定固定化微生物顆粒降解HPAM和原油的 效果。
圖4混合菌與單菌對(duì)原油去除率的比較
滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。
3.4混合菌的優(yōu)勢(shì)
由圖3、圖4可知，Rl、R2、R3、Y3四種單 菌組成的混合菌對(duì)HPAM和原油的去除率都明顯
5種包埋法制備固定化顆粒的難易程度、小球
• 950 •化 工進(jìn)展2013年第32卷
表2 5種包埋固定化方法的比較
包埋方法制備難易小球強(qiáng)度和初性費(fèi)用
海藻酸鈉+活性炭粉操作較簡(jiǎn)單，成球容易，小球體積較小小球有一定的韌性，但強(qiáng)度不好，易破碎較低
海藻酸鈉包埋與戊二醛交聯(lián)結(jié)合操作較簡(jiǎn)單，成球容易，小球體積較小小球韌性、強(qiáng)度較一般較高
PVA+海藻酸鈉+添加劑操作較簡(jiǎn)單，成球容易，小球體積較大固定化小球韌性一般，但強(qiáng)度好，球體硬低
PVA冷凍操作相對(duì)簡(jiǎn)便，較易成球，小球體積較小強(qiáng)度一般，韌性很好低
明膠一戊二醛操作較困難，明膠黏性較大，不易成球，小球的形固定化小球強(qiáng)度很好，有初性較高
狀不規(guī)則
表3固定化顆粒降解HPAM和原油的效果
包埋方法聚丙烯酰胺的降解率/%原油去除率
海藻酸鈉+活性炭粉60.381.4
PVA+海藻酸鈉+添加劑78.298.3
PVA冷凍61.481.2
強(qiáng)度和初性以及制備費(fèi)用比較如表2所示。
(2)微生物固定化顆粒降解HPAM和原油的 效果通過(guò)由表2篩選出的3種包埋固定化方法制 得的固定化顆粒對(duì)聚丙烯酰胺的降解率的測(cè)定， 結(jié)果如表3所示，海藻酸鈉+活性炭粉法與PVA冷 凍法對(duì)聚丙烯酰胺降解率與對(duì)原油的去除率低于 PVA+海藻酸鈉+添加劑法。因此，排除海藻酸鈉+ 活性炭粉法與PVA冷凍法兩種方法。
綜合表2與表3,得知PVA+海藻酸鈉+添加 劑法制得的固定化顆粒的活性較好，操作簡(jiǎn) 單，強(qiáng)度好，不易破損，且費(fèi)用低，PVA+海藻 酸鈉+添加劑法對(duì)聚丙烯酰胺的降解率高于其它 兩種包埋方法。因此選用PVA+海藻酸鈉+添加 劑法對(duì)含聚丙烯酰胺的土壤進(jìn)行處理。張秀霞 等[1()]以天然有機(jī)材料YJ-05為載體，采用吸附 法制備固定化MM-7對(duì)土壤中石油的降解率可 達(dá)到27.1%。
由之前的實(shí)驗(yàn)3.4節(jié)混合菌的優(yōu)勢(shì)可知，游離 的混合菌對(duì)HPAM降解率達(dá)到55%以上，對(duì)原油 的去除率可達(dá)到75%以上，而由表3得知在相同實(shí) 驗(yàn)條件下PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的固定化 顆粒對(duì)聚丙烯酰胺的降解率可達(dá)到78.2%，對(duì)原油 的去處率可達(dá)到98.3%。可見(jiàn)固定化后的菌株對(duì)聚 丙烯酰胺與原油的處理能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于沒(méi)有固定 化的游離菌株。
PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的固定化顆粒 如圖5所示。圖5(a)為10%PVA-1%海藻酸鈉與濕 菌體按1 : 2體積比混合后，加入3%Si02,
0.3%CaCO3。用5 mL注射器注射到2%的CaCl2飽 和硼酸溶液中成球，CaCl2與飽和硼酸共同交聯(lián)24 h后的固定化顆粒，顆粒并無(wú)拖尾現(xiàn)象。圖5(b)為 在相同制備方法時(shí)加入3%的活性炭制得的固定化 顆粒，以增加固定化顆粒的通透性，提高微生物 的活性。
3.6微生物固定化處理采油污水污染土壤
PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的微生物固定 化顆粒處理采油污水污染的土壤，處理后的土壤 樣品放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥后送回井場(chǎng)，固 定化顆粒降解土壤中HPAM和原油的效果實(shí)驗(yàn)結(jié) 果如表4所示。由表4可以看出，PVA+海藻酸鈉+ 添加劑法制備的固定化顆粒對(duì)采油污水污染土壤 進(jìn)行處理，固定化顆粒對(duì)HPAM、原油的去除率 分別為79.5%和98.7%。
表4固定化顆粒降解土壤中HPAM和原油的效果
時(shí)間
/dHPAM含量 /mg-L_IHPAM降解率
/%原油含量 /mg.L_1原油降解率
/%
0500.050733.210
3102.5179.519.598.7
622.2178.31.5184.1
97.6265.70.3676.2
123.2157.80.0975
151.4156.10.0455.6
180.62560.0250
210.27560.0150
4結(jié)論
(1)實(shí)驗(yàn)以篩選出以聚丙烯酰胺作為唯一碳 源和唯一氮源的菌株為目的，從含HPAM的土壤 中分離、純化得到對(duì)HPAM具有高效降解能力的 Rl、R2、R3、Y3四種單菌。對(duì)篩選出的單菌進(jìn)行 鑒定可知：R1為芽孢乳桿菌屬，R2為微球菌屬， R3、Y3為假單胞菌屬菌株。
(2)將 Rl、R2、R3、Y3 混合，在 35°C, 120 r/min條件下，混合菌對(duì)HPAM的降解率可達(dá)到 55%以上，對(duì)原油的去除率達(dá)到75%以上。明顯高 于4種單一菌種對(duì)HPAM和原油的去除率。
(3)為提高混合菌對(duì)聚丙烯酰胺與原油的去除 率，采用固定化法對(duì)混合菌進(jìn)行固定化實(shí)驗(yàn)。比 較5種包埋固定化法得知，PVA+海藻酸鈉+添加劑 法對(duì)聚丙烯酰胺與原油的去除率高于其它4種包埋 固定化方法。PVA+海藻酸鈉+添加劑法制得的固 定化顆粒的活性較好，操作簡(jiǎn)單，強(qiáng)度好，不易 破損，且費(fèi)用低。
(4)游離的混合菌對(duì)HPAM與原油的去除率 可達(dá)到75%與55%以上，而PVA+海藻酸鈉+添加 劑法制得的固定化顆粒對(duì)聚丙烯酰胺與原油的去 處率可達(dá)到78.2%與98.3%?？梢?jiàn)固定化后的菌株 對(duì)聚丙烯酰胺與原油的處理能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于沒(méi)有 固定化的游離菌株。
(5)PVA+海藻酸鈉+添加劑法制備的固定化 顆粒對(duì)采油污水污染土壤進(jìn)行處理，聚丙烯酰胺 的去除率可達(dá)到79.5%，原油的去除率可達(dá)到 98.7%。