近年來(lái)，以重組DNA和單克隆抗體技術(shù)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、疫苗、抗體和 細(xì)胞生長(zhǎng)因子等生物技術(shù)藥物，成為了熒光漂白恢復(fù)技術(shù)越來(lái)越熱門(mén)的研究對(duì)象總體上它們具有幾個(gè) 共同的特點(diǎn)[2]:第一，分子量較大，熱穩(wěn)定性差，易被蛋白質(zhì)水解酶水解;第二，生物利用 度不高，具有較強(qiáng)的親水性，不易通過(guò)生物屏障;第三，具有特定的維結(jié)構(gòu)，任何改變其 結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)和環(huán)境都會(huì)對(duì)生物活性造成很大的影響。生物大分子藥物透皮給藥技術(shù) 的發(fā)展，使蛋白類(lèi)藥物能夠避免胃腸道的酶解和肝臟的首過(guò)效應(yīng)，提高藥物的生物利用 度。與此同時(shí)，兼顧蛋白質(zhì)類(lèi)藥物穩(wěn)定性的藥物載體的研究，也已經(jīng)成為人們所關(guān)注的焦點(diǎn)。

現(xiàn)今比較常用的一種藥物載體是水凝膠，它廣泛應(yīng)用于生物制藥等領(lǐng)域M.具有互 相貫穿的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠能夠吸取大量的水形成穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分子在水凝膠 中親水基團(tuán)的幫助下，有助于保持其生物結(jié)構(gòu)和活性?卡波姆(carb〇mer)就是其中一種 已經(jīng)商品化的水凝膠[4]，根據(jù)材料和聚合度的不同可以分為兩個(gè)系列：卡波姆9〇〇系列， 由丙烯酸單聚物與烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交聯(lián);卡波姆1300系列，為丙烯酸烷基 異丁烯酸共聚物與烯丙基季戊四醇交聯(lián)?卡波姆具有高穩(wěn)定性、生物相容性以及低毒性 的優(yōu)點(diǎn)，但是作為透皮給藥制劑的載體，具有與皮膚的粘附性差，藥物釋放可控度低的缺 點(diǎn)。因此為了開(kāi)發(fā)蛋白類(lèi)藥物的透皮給藥制劑，首先需要研究合適的藥物載體。這種藥物 載體在具有優(yōu)良生物相容性、皮膚粘附性特點(diǎn)的同時(shí)，還應(yīng)具有良好的藥物釋放可控性。 為了能夠直觀地研究蛋白類(lèi)藥物在載體中的擴(kuò)散規(guī)律，激光掃描共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)成像 技術(shù)與突光漂白恢復(fù)（fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RAP)技術(shù)1"5]相結(jié)合， 被用來(lái)開(kāi)展蛋白藥物在凝膠載體中擴(kuò)散系數(shù)的研究。主要原理是借助高強(qiáng)度脈沖式激光 照射凝膠中的某一區(qū)域，從而造成該區(qū)域被熒光標(biāo)記的蛋白發(fā)生熒光漂白。然后通過(guò)低 強(qiáng)度激光掃描，記錄該區(qū)域周?chē)雌椎臒晒鈽?biāo)記的蛋白向被照射區(qū)域擴(kuò)散的速度M. 在本文中，我們合成了低分子量的不同單體配比的系列聚丙烯丑胺-丙稀酸（p(Am-co~ Ac))作為水凝膠藥物載體，應(yīng)用紅外光譜表征其結(jié)構(gòu)特性?以FITC標(biāo)記的牛血清白蛋 白（BSA)作為藥物模型分子，通過(guò)FRAP實(shí)驗(yàn)，考察FITC-BSA在P(Am-co~Ac)共聚物 凝膠中的擴(kuò)散行為。通過(guò)這些研究，揭示了不同單體配比的P(Am-C〇"Ac)水凝膠對(duì)BSA 蛋白擴(kuò)散的影響，為蛋白質(zhì)凝膠載體的進(jìn)一步深入研究提供了科學(xué)依據(jù)。

 

1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與試劑儀器：EASYPure LF超純水制取設(shè)備（美國(guó)Barnsted公司）；Excalibur HE 3100傅 立葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Varian公司）;Nikon Cl si全光譜激光掃描共聚焦顯微鏡（日 本Nikon公司).

 

試劑：異硫氰酸熒光素(FITC)(北京成文免疫化學(xué)研究室）；牛血清白蛋白（RSA)標(biāo) 準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所）；丙烯酰胺（Am)(電化學(xué)純度，Acros公司）；丙烯酸 (Ac)(電泳純度，Acros公司，使用前進(jìn)行純化）；N, N-甲叉雙丙烯酰胺(BIS)(分析純， agma-Aldrich公司）;偶氮二異丁腈(MBAm)(分析純，北京化工試劑廠）；氯化鈉、氯化 鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為分析純?cè)噭?，所有?shí)驗(yàn)用水均為超純水。

 

1.2交聯(lián)聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物的制備將丙烯丑胺和N，N-甲叉雙丙烯酰胺(BIS)加入圓底燒瓶中，然后加入30 mL丙酮 使其完全溶解。通人氮?dú)?0 min驅(qū)除溶解在溶液中的氧氣?室溫下加入〇。 5%(質(zhì)量分 數(shù))的引發(fā)劑偶氮二異丁腈(MBAm)，繼續(xù)通入氮?dú)?0 min后，逐滴滴加丙烯酸溶液。緩 慢升溫至65 °C，反應(yīng)10 min后，出現(xiàn)白色沉淀。反應(yīng)持續(xù)3 h，停止反應(yīng)，可觀察到明顯 的白色渾濁溶液。反應(yīng)完畢后，按100 mL/g的比例，用無(wú)水乙醇溶解初產(chǎn)物，攪拌1〇

 

min后抽濾。重復(fù)洗滌抽濾5次后，得到白色固體粉末?置于60 X：烘箱中6 h，即得到干 燥的白色粉末。根據(jù)單體配比的不同，共制備得到4種不同組成的共聚物。表1列出了 其單體比例。

 

表1制備聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物中丙烯酰胺和丙烯酸比例及其他試劑條件Polymerization conditions of P(Am-co-Ac)copolymersAcrylamideAcrylic acidBISMBAmAcetone (mL)

 

60%40%5%〇2%〇3070%30%5%〇2%〇3080%20%5%〇2%〇3087.5%12.5%5%〇2%301.3聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物的紅外表征將樣品與預(yù)先干燥好的KBr(分析純)混合后（樣品與KBr質(zhì)量比為1 : 100)，于瑪 瑙研缽中研磨均勻，然后壓片制樣?采用Varian 3100 FT-IR Excalibur series紅外分析 儀，對(duì)P(Am-C〇~Ac)進(jìn)行紅外分析。掃描次數(shù)為64次，分辨率為2 cm—1，掃描范圍為 400-—4000 cm—1,實(shí)驗(yàn)溫度為 25 °C.

 

1. 4異硫氰酸熒光素標(biāo)記牛血清白蛋白FITC-BSA的制備按P : F(BSA : FITC) = 8 : 1的比例，將FITC緩緩加入到BSA蛋白溶液中，4 X： 下避光攪拌3 h,經(jīng)高速離心去除變性蛋白。以Sepheader G~50柱分離，去除游離的 FITC，對(duì)FITC標(biāo)記的BSA分管收集，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定其FITC及BSA蛋白濃度，制 得 FITC-BSA(標(biāo)記比 Mmr : %脫=1. 75, _ = 15. 12 mg/mL).

 

1.5聚丙烯酰胺-丙烯酸(P(Anw^Ac))凝膠樣品制備pH=7. 4 的磷酸鹽緩沖液(PBS)配制方法：取 〇。 2044 g KC1，0? 2634 g KH2P04， 8.0044 gNaCl，1.4410gNa2HP〇4 ? 12H20 于 1 L 燒杯中，加入 950 mL 超純水溶解 后，調(diào)節(jié)pH至7. 4,然后定容至1.0 L.

 

BSA蛋白凝膠樣品制備方法：（1)配制共聚物濃度為1.5 %，F(xiàn)ITC-BSA濃度分別為 1 mg/mL, 2 mg/mL，3 mg/mL的水凝膠。（2)將凝膠滴于圓形載玻片上，保證樣品厚度 為50 pm?另外，溫度會(huì)影響FITC-BSA擴(kuò)散速率的測(cè)定，因此室溫保持在23 C.

 

1.6應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光漂白恢復(fù)(FRAP)測(cè)定為了研究FITC-BSA在凝膠分子中的擴(kuò)散系數(shù)，使用氬離子激光器，在光斑模式下 (TEM^Mode)在480 rnn的波長(zhǎng)下照射載玻片上的FITC-BSA蛋白凝膠樣品?使用20 倍鏡頭觀察樣品。在觀察的區(qū)域內(nèi)選擇直徑為2〇 fxm的圓形區(qū)域作為漂白范圍。使用 100%的激光能源在/ = 〇時(shí)刻，將光斑內(nèi)FITC-BSA迅速漂白。然后再次監(jiān)測(cè)漂白區(qū) FITC-BSA的熒光恢復(fù)情況，每隔5 s記錄熒光恢復(fù)情況圖像。另外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用于監(jiān) 測(cè)掃描的熒光強(qiáng)度選擇在不對(duì)樣品熒光產(chǎn)生漂白的強(qiáng)度，為激光器能源的28. 2%.

 

1.7熒光漂白恢復(fù)(FRAP)數(shù)據(jù)分析FRAP的數(shù)據(jù)分析，采用文獻(xiàn)中提到的用于研究蛋白質(zhì)在凝膠中的擴(kuò)散研究公 式[7].在漂白區(qū)域內(nèi)，蛋白的擴(kuò)散過(guò)程由二維擴(kuò)散方程表示：c(w，t;，f)=c(M，x)，0)exp[—4；T(M2+T/)Z>](1)

 

其中M和是空間頻率?同時(shí)，根據(jù)Tanke等人先前的研究，焚光蛋白濃度降低所引 起的內(nèi)部衍射和重吸收可以忽略不計(jì)。因此熒光恢復(fù)強(qiáng)度則成為時(shí)間的一次函數(shù)。根據(jù) 傅立葉變換，二維擴(kuò)散方程可變化為：I(u,v,t)=c(.u,v,t)OTF(u,v)(2)

 

其中是某處的熒光強(qiáng)度。再與光學(xué)傳遞函數(shù)變換結(jié)合則熒光恢復(fù)方程為：I / I〇=c/c〇 =exp[—4n2qzDt'](3)

 

其中 7〇= KM,取，0)，c〇 =C(M，T;，0)，M2+為擴(kuò)散系數(shù)。由 J//〇對(duì)一47r2g2f的線性模擬可求得擴(kuò)散系數(shù)D.

 

2結(jié)果與討論2.1聚丙烯酰胺丙烯酸共聚物的制備和表征本實(shí)驗(yàn)中采用水相聚合的方法制備聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物[8]，其目的在于控制聚 合物的分子量?根據(jù)文獻(xiàn)中的報(bào)道[9]，采用沉淀聚合的方法，可以得到分子量較低的共聚 物?因?yàn)樵诔恋砭酆线^(guò)程中所使用的有機(jī)溶劑丙酮對(duì)丙烯酰胺的聚合是很活潑的鏈轉(zhuǎn)移 劑，且當(dāng)聚合物的分子鏈增長(zhǎng)到一定長(zhǎng)度后便會(huì)沉淀下來(lái)，因而限制了分子鏈的進(jìn)一步 增長(zhǎng)，故所得產(chǎn)物分子量較低[1°].利用該方法合成的聚合物具有溶脹快、粘附性良好的 優(yōu)點(diǎn)?反應(yīng)結(jié)束后，以乙醇洗滌、抽濾，并以HPLC檢驗(yàn)濾液中丙烯酰胺(Am)單體的含 量?直至濾液中存在的單體含量小于0.1/xg/mL?為了確定共聚物的組成，我們采用紅 外光譜對(duì)聚合物進(jìn)行分析[11].

 

圖1交聯(lián)聚合物P(Am~co>Ac)的紅外譜圖 The FTIR of P(Am-co-Ac) with different [Am]/[Ac] ratios圖1為P(Am-c〇"Ac)聚合物的紅外譜圖。在圖1 PAAM的紅外譜圖中，3345 cm-1 處為丙烯酰胺的一NH2的伸縮振動(dòng)，3190 cm-1處為酰胺I帶吸收峰，1663 cm—1為羰基伸 縮振動(dòng)峰，而1613 cm—1處為一NH2的變形振動(dòng)，這些吸收峰證實(shí)了聚丙烯酰胺的特征結(jié) 構(gòu)?而隨體系中丙烯酸含量從〇%逐漸增加到30%時(shí)，一NH2的特征吸收峰強(qiáng)度逐漸減 弱，這說(shuō)明聚合物中丙烯酰胺單體逐漸減少?由于聚合物中丙烯酰胺單體的吸收峰很強(qiáng)， 遮蓋了位于1718 cm—1處的丙烯酸(一COOH)特征吸收峰。當(dāng)丙烯酸含量從30%增加到 40%的時(shí)候，位于1718 cm—1處的丙烯酸特征峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)和1613 cnT1處一NH2吸收 峰的減弱，證實(shí)了聚合物中單體的含量改變。在丙烯酸含量為30%、4〇%的聚合物紅外 譜圖中，可以明顯看到兼有丙烯酰胺和丙稀酸特征的吸收峰。

 

2.2F1TC-BSA濃度對(duì)于熒光漂白及恢復(fù)的影響FRAP技術(shù)是一種基于分子自由擴(kuò)散的熒光檢測(cè)方法。它是一種應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)熒光 檢測(cè)的方法，直到1991年Tsay和Jacobson將FRAP引入到凝膠內(nèi)分子擴(kuò)散的研究后， 逐漸成為研究凝膠中分子擴(kuò)散的最直接、最有效的研究方法L12]?本實(shí)驗(yàn)中選用的牛血清 白蛋白，是一種比較成熟的蛋白模型，常作為模型藥物用于蛋白制劑的研究?通過(guò)激光掃 描共聚焦顯微鏡，觀察熒光漂白后FITC-BSA在凝膠中的擴(kuò)散情況，以便能定性觀察并 且定量地計(jì)算FTTC-BSA在凝膠中的擴(kuò)散系數(shù)。實(shí)驗(yàn)中，我們首先考察FTTC-BSA濃度 對(duì)于熒光漂白恢復(fù)(FRAP)實(shí)驗(yàn)的影響?在480 nm波長(zhǎng)處采用不同的激發(fā)強(qiáng)度掃描并記 錄圖片，然后采用100%的激光強(qiáng)度對(duì)選定的圓形范圍內(nèi)進(jìn)行熒光漂白，再使用與漂白前 相同激光強(qiáng)度觀察并記錄漂白區(qū)域內(nèi)的熒光恢復(fù)情況（每隔5 s進(jìn)行一次拍照)?實(shí)驗(yàn)表 明，F(xiàn)ITC-BSA濃度為2 mg/mL和3 mg/mL的水凝膠熒光成像清晰，但漂白效果較差， 漂白區(qū)域與非漂白區(qū)域?qū)Ρ榷鹊?。相比之下? mg/mL的FITC-BSA,其漂白和成像效果 均較好，能夠得到直觀的漂白恢復(fù)過(guò)程，因此選擇FITC>BSA的濃度為111^/"^.

 

2.31 mg/mL FITC-BSA熒光漂白恢復(fù)的計(jì)算結(jié)果為了減少FRAP儀器本身帶來(lái)的誤差和保證檢驗(yàn)方法的穩(wěn)定性，定量測(cè)定之前，必 須對(duì)熒光恢復(fù)的可信度進(jìn)行驗(yàn)證，然后再對(duì)不同丙烯酸含量共聚物的蛋白質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)行定 量分析。因此，首先使用1 mg/mL的FITC-BSA水溶液進(jìn)行熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié) 果利用公式(3)計(jì)算，1 mg/mL的FITC-BSA擴(kuò)散系數(shù)為6. 8( 土 0. 4) X 10一7 Cm2/S.根 據(jù)文獻(xiàn)中的報(bào)道[7]，在23 °C時(shí)FITC和BSA的擴(kuò)散系數(shù)如下：DFrrc = 26( 士 4)X 10_7 cm2/s，DBSA = 6.〇 (土 4)Xl(T7cm2/s.因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究中建立的熒光漂白恢 復(fù)方法和設(shè)備測(cè)量得到的數(shù)據(jù)較為可信。表2總結(jié)了在不同丙烯酰胺和丙烯酸比例的 P(Arn-caAc)共聚物中FITC-BSA的擴(kuò)散系數(shù)?圖2為FRAP實(shí)驗(yàn)中FITC-BSA在表2 FRAP技術(shù)測(cè)定P(An?〇"Ac)共聚物中FITC-BSA的擴(kuò)散系數(shù)The diffusion coefficients of FITC-BSA in polyacrylamide-co-acrylic acid gelsAqueous12.5%Acrylic acid ratio20%Acrylic acid ratio30%Acrylic acid ratioA〇%Acrylic acid ratioDiffusion coefficient (X10-7 cm"2/s)6.5( 士 l.〇〇>0.52( 士 0? 19)2.1(士 0.51)0.59( 土 0.07)0.47( 士 0.03)

 

1 mg/mL濃度時(shí)的熒光恢復(fù)情況?結(jié)果表明，P(Am-cc^AC)共聚物單體的組成對(duì)BSA 蛋白的擴(kuò)散系數(shù)具有顯著的影響，丙烯酸含量為20%時(shí)蛋白質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)最大。當(dāng)丙烯 酸含量從12. 5%增加到20%的時(shí)候，蛋白質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)明顯增加?而當(dāng)丙烯酸含量從圖2 FITC-BSA在不同溶液中的熒光漂白前、漂白后和最后恢復(fù)的情況 The FITC-BSA in different solutions before bleaching, after bleaching* and recovering respectively (a)—(c):水溶液中FITC-BSA的熒光漂白前、漂白后和最后恢復(fù)的情況;(d)—(f): 12.5%丙烯酸含厘的共聚物中; (g)—(i): 20%丙烯酸含量的共聚物中;(j)—(1): 30%丙烯酸含量的共聚物中；（m)—(〇): 40%丙烯酸含量的共聚物中 (a)—(c)： the FITC-BSA in aqueous solution before bleaching, after bleaching, and recovering respectively, (d)—(f)： the FITC-BSA in polymer(12. 5 %)* (g) — (i)： the FITC-BSA in polymer(20//〇),(j)一（1): The FITC-BSA in polymer(30%)，（m)—(n)： The FITC-BSA in polymer(40%)

 

20%增加到30%直至40%的時(shí)候，其中蛋白質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)又明顯下降。這說(shuō)明蛋白質(zhì)的 擴(kuò)散系數(shù)與其中丙烯酸含量有關(guān)。丙烯丑胺與丙烯酸單體比例的差異會(huì)導(dǎo)致其三維結(jié)構(gòu) 的差別。蛋白的擴(kuò)散速度與其交聯(lián)聚合物的三維結(jié)構(gòu)有關(guān)，至于是否與蛋白的電荷有關(guān)， 這還需要進(jìn)一步的研究。

 

3結(jié)論通過(guò)對(duì)FITC-BSA蛋白在聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物中的擴(kuò)散研究，能夠定性并且 定量分析蛋白的熒光漂白恢復(fù)(FRAP)情況。從蛋白擴(kuò)散系數(shù)中可以看出：首先，隨著丙 烯丑胺和丙烯酸比例的變化，F(xiàn)ITC-BSA蛋白在共聚物中的擴(kuò)散系數(shù)產(chǎn)生了明顯的變化。 可能是因?yàn)榻宦?lián)共聚物的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，從而影響B(tài)SA蛋白的擴(kuò)散系數(shù)；其 次，說(shuō)明熒光漂白恢復(fù)(FRAP)技術(shù)確實(shí)能夠直接而有效地觀察蛋白在凝膠制劑中的擴(kuò) 散情況，從而為體外篩選蛋白藥物載體提供了新方法。與傳統(tǒng)的體外擴(kuò)散相比，它具有更 直觀、更簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。因此，F(xiàn)RAP技術(shù)在凝膠藥劑開(kāi)發(fā)這一領(lǐng)域中將具有越來(lái)越重要的 應(yīng)用。最后，F(xiàn)ITC-BSA在不同單體比例的聚丙烯酰胺-丙烯酸(P(Am-cc^Ac))共聚物中 的擴(kuò)散行為不同，表明該共聚物對(duì)牛血清白蛋白（BSA)具有優(yōu)良的釋放控制性，具有潛 在的應(yīng)用價(jià)值。