降解菌的降解能力研究和降解機(jī)理初探，從HPAM污染污水和土壤中分離篩選得到了兩株對(duì)HPAM有降解潛力的菌株假單 胞菌CJ419和枯草芽孢桿菌FA16,將兩菌株接種于以HPAM為唯一碳源和氮源的API 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)并檢測(cè)菌株對(duì)HPAM的降解作用。

聚丙烯酰胺的降解通常分為氧化降解、生物降解、機(jī)械降解和熱降解等類型，其降 解機(jī)理近年來已成為研究熱點(diǎn)。而近幾年少有聚丙烯酰胺生物降解的機(jī)理研究報(bào)道。本 研究對(duì)混合菌各菌株的細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)分析，通過檢測(cè)聚丙烯酰胺的分子量初 步討論了聚合物的生化降解途徑，對(duì)復(fù)合菌降解HPAM的機(jī)理進(jìn)行了初步探索。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1菌種

前實(shí)驗(yàn)中得到的菌株CJ419和FA16。

1.2主要試劑與儀器

主要試劑為實(shí)驗(yàn)室常用試劑，化學(xué)純。

主要儀器列表如下：

表3-1主要實(shí)驗(yàn)儀器 Table3-1 Main experimental apparatus

儀器名稱生產(chǎn)公司

SartoriusBS210S 電子天平北京賽文利斯大平有限公司

Eclipse E200 顯微鏡日本尼康公司

LDZX40BI立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠

GZX-DH 400-BS-II電熱恒溫干燥箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠

SXK-103超凈工作臺(tái)安徽蚌埠凈化設(shè)備廠

DNP-9052細(xì)菌培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠

ZHWY-A211C臥式旋轉(zhuǎn)型搖床上海智城分析儀器制造有限公司

SPX-250丨C人工氣候箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司

烏氏粘度計(jì)北京儀器廠

722型分光光度計(jì)上海第三儀器廠

PYX-DHS-35x40隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠

稱量瓶，錐形瓶，50 mL比色管，移液管各若千。

試劑為微生物分離培養(yǎng)所需各類常用培養(yǎng)、檢測(cè)常用試劑和藥品。

1.3培養(yǎng)基與材料

改進(jìn)型API培養(yǎng)基[5()]。其組成如下：乳酸鈉4ml，KH2P040.02g, NaCllOg, MgS04*7H20 為 0.2g，維生素 C0.2g,酵母膏 l.Og,模擬水為 1000ml 的 lg/LHPAM。 降解菌的降解能力研究和降解機(jī)理初探，滅菌冷卻后加入經(jīng)紫外滅菌的FeS04(NH4)2S04 • 6H20。

實(shí)驗(yàn)原廢水樣品為陜西長(zhǎng)慶油田某污水處理站經(jīng)過沉降砂濾處理后的出水，水溫 35-40°C，含烴類物質(zhì)總量質(zhì)量濃度<10mg/L,懸浮物<10mg/L，COD 600-650mg/L,聚 合物質(zhì)量濃度500mg/L，HPAM分子量0.6-2.0X 1〇7,濁度30?80 NTU。

實(shí)驗(yàn)用部分水解聚丙烯酰胺分子量1.7-2.2X107,水解度18.6-29.3%，高效pH范圍 4-13,固含量290%，殘單0.05-0.15%，白色顆粒粉末，由鞏義市拓普凈水材料有限公司 提供。

實(shí)驗(yàn)用模擬水成分如下：CaCl20.11g，NaC10.06g, NaHC03 1.38g，Na2S040.07g, 蒸餾水1000 mLHPAM降解培養(yǎng)基使用模擬水加入lg/L的高分HPAM配制，高分HPAM 的分子量為1.7-2.2 XI 〇7。

2方法

2.1分析方法

2.1.1微生物生物量分析

采用細(xì)菌測(cè)試瓶絕跡稀釋法[511研究最大可能菌量，細(xì)菌測(cè)試瓶由北京中西遠(yuǎn)大科技 有限公司提供。

2.1. 2 HPAM降解率分析——聚丙烯酰胺的質(zhì)量濃度的測(cè)定

用722型分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，繪制質(zhì)量濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此確定溶 液中聚丙烯酰胺的質(zhì)量濃度。采用淀粉-碘化鎘法[52]測(cè)定聚丙烯酰胺的質(zhì)量濃度，生物 降解率n (%)的表達(dá)式為：

r\= (p0-pl)/p〇x100%(1)

式中（1): p0表示降解前聚丙烯酰胺的質(zhì)量濃度（mg/L); pi表示降解后聚丙烯酰 胺的質(zhì)量濃度（mg/L)。實(shí)驗(yàn)中計(jì)算生物降解率時(shí)必須扣除空白溶液中因剪切作用而導(dǎo) 致的聚丙烯酰胺含量的變化。由（1)式計(jì)算聚丙烯酰胺的降解率，從而得到不同的生

長(zhǎng)階段對(duì)HPAM降解的情況。

淀粉-碘化鎘光度法的試劑配置方法為：

醋酸鈉緩沖液的配置:將25 g水合醋酸鈉溶解在800 mL H20中，在溶液中加入0.50 g水合硫酸鋁，醋酸調(diào)節(jié)pH至5.0,最后稀釋至1000 mL備用。

淀粉-碘化鎘試劑的配置：使用電子天平準(zhǔn)確稱量11 g碘化鎘，溶解在400mLH20 中加熱，沸騰后需煮沸10 min,稍待冷卻后稀釋至約800mL，在溶液中加入2.5 g可溶 性淀粉攪拌均勻充分溶解，再用濾紙過濾，將溶液稀釋至1000 mL。

聚合物HPAM(1000 mg/L):在50 mL燒杯中加入大約30 mL H20,將準(zhǔn)確稱取的 0.1000gHPAM(鞏義市拓普凈水材料有限公司提供)，放入燒杯中，全部溶解后轉(zhuǎn)移至 100mL容量瓶中，使用少量水沖洗燒杯3-5次，將沖洗過的水也轉(zhuǎn)移到容量瓶中，上下 搖動(dòng)容量瓶使瓶?jī)?nèi)溶液混合均勻，向容量瓶中加水至刻度，搖勻溶液，將容量瓶放入超 聲清洗器中超聲震蕩l〇min以上使溶液更加均勻。

Br2/KBr溶液：將0.45 mL液態(tài)Br2與30g KBr用少量H20溶解，并配稀釋制成500 mL溶液。

具體實(shí)驗(yàn)步驟為：用移液管移取5 mL醋酸鈉緩沖液于50 mL容量瓶中，加入20 mL 蒸餾水和2 mL的HPAM溶液。將蒸餾水和HPAM溶液充分混合，加入2 mL Br2/KBr 溶液，反應(yīng)10 min。之后加入1%的甲酸鈉溶液5 mL,充分混合搖勻，反應(yīng)5 min。反 應(yīng)完成后加入5 mL淀粉-碘化鎘試劑，用蒸館水定容至50mL，充分搖勻，靜置10 min。 用722型分光光度計(jì)在580 nm處，以蒸餾水作參比溶液，按質(zhì)量濃度由小到大測(cè)其吸 光度。

實(shí)驗(yàn)具體原理為：（a)使用Br2/KBr溶液，將聚合物溶液中的酰胺基溴化為1ST溴代 酰胺；（b)加入還原劑甲酸鈉，除去過量的Br2; (c) (a)中生成的聚丙烯酰胺溴代 物水解，產(chǎn)生次溴酸；（d)在pH為5.0的酸性條件下，次溴酸定量的與碘化鎘中r反應(yīng) 生成產(chǎn)；（e)I3_與淀粉作用呈藍(lán)色，在580nm處用分光光度法測(cè)定。

2.1. 3聚丙烯酰胺粘均分子量的測(cè)定方法

使用粘度法測(cè)量HPAM相對(duì)分子量[53]。粘度法測(cè)定高分子聚合物相對(duì)分子量的經(jīng)驗(yàn) 公式為麥克非(H.Mark)線性方程即：

["]=KMa(2)

(2)式中，M為黏均摩爾質(zhì)量；K是比例常數(shù)，與溫度、高聚物、溶劑性質(zhì)等有 關(guān)；a是與分子形狀有關(guān)的經(jīng)驗(yàn)參數(shù)。其數(shù)值介于0.5-1之間。K和a的數(shù)值可以通過其 他絕對(duì)方法確定?？梢钥闯鰷y(cè)高聚物的摩爾質(zhì)量最后歸結(jié)為對(duì)特性粘度[//]的測(cè)定。本實(shí) 驗(yàn)使用毛細(xì)管法測(cè)定黏度。當(dāng)液體在重力作用下流經(jīng)毛細(xì)管時(shí)，遵守以下定律：

rj7uhgr4tV

m

p 8VL8nLt

(3)

測(cè)定步驟如下[54]:

(a)先用熱洗液（經(jīng)砂芯漏斗過濾）將粘度計(jì)浸泡，再用自來水、蒸餾水分別沖洗幾 次，每次都要注意反復(fù)沖洗毛細(xì)管部分，洗好后烘干備用。

(b)調(diào)節(jié)恒溫槽溫度至30.0°C，在粘度計(jì)的B管和C管上都套上橡皮管，然后將其垂 直放入恒溫槽，使水面完全浸沒G球，使用掉錘檢查是否垂直。

(c)用移液管分別吸取己知濃度的聚丙烯酰胺溶液10mL和NaN03溶液(3mol/L) 5mL, 由A管注入粘度計(jì)中，在C管處用洗耳球打氣，使溶液混合均勻，濃度記為C1，恒溫 15 min,進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法如下：將C管用夾子使之不通氣，在B管用洗耳球?qū)⑷芤?從F球經(jīng)D球、毛細(xì)管、E球抽至G球2/3處，解去夾子，讓C管通氣，此時(shí)D球內(nèi) 的溶液即回入F球，使毛細(xì)管以上的液體懸空。毛細(xì)管以上的液體下落，當(dāng)液面流經(jīng)a 刻度時(shí)，立即按停表開始記時(shí)間，當(dāng)液面降至b刻度時(shí)，再按停表，測(cè)得刻度a、b之 間的液體流經(jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間。重復(fù)這一操作至少三次，它們間相差不大于0.3 s,取三 次的平均值為tl。

(3)然后依次由A管用移液管加入5 mL、5 mL、10 mL、15 mLNaN03溶液(lmol/L), 將溶液稀釋，使溶液濃度分別為C2、C3、C4、C5,按實(shí)驗(yàn)（3)的步驟用同法測(cè)定每 份溶液流經(jīng)毛細(xì)管的時(shí)間t2、t3、t4、t5。應(yīng)注意每次加入NaN03溶液后，要充分合均 勻，并抽洗粘度計(jì)的E球和G球，使粘度計(jì)內(nèi)溶液各處的濃度相等。

(4)溶劑流出時(shí)間的測(cè)定。用蒸餾水洗凈粘度計(jì)，尤其要反復(fù)流洗粘度計(jì)的毛細(xì)管部 分。用1 mol/LNaN03洗1?2次，然后由A管加入約15mL lmol/L NaN03溶液。用同 法測(cè)定溶劑流出的時(shí)間t〇»

(5)使用毛細(xì)管法測(cè)定粘度，通過測(cè)定一定體積的液體流經(jīng)一定長(zhǎng)度和半徑的毛細(xì)管 所需的時(shí)間而獲得。由（3)式得到[7]，30°C聚丙烯酰胺的K337.3X10"6，a=0.66。由 此求出粘均分子量M。

(6)實(shí)驗(yàn)完畢后，黏度劑一定要用蒸餾水洗干凈。 2. 2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1降解菌的活化培養(yǎng)

取出冰箱中存放的從長(zhǎng)慶油田現(xiàn)場(chǎng)取樣純化富集的兩菌株經(jīng)API培養(yǎng)基活化后以 體積比為2%的比例接種到HPAM降解培養(yǎng)基中[55]，30°C恒溫培養(yǎng)24 h后再按同樣比例 接種一次，連續(xù)活化4-5次，測(cè)量菌數(shù)至107cells/ml以上，取此液作為試驗(yàn)菌液。

2. 2. 2對(duì)照組設(shè)置方法

以120°C滅菌30min的實(shí)驗(yàn)廢水樣品作為對(duì)照組。降解菌的降解能力研究和降解機(jī)理初探，初始溫度30°C搖瓶培養(yǎng)25d，定 期測(cè)定HPAM質(zhì)量濃度的變化，同時(shí)檢測(cè)微生物生物量。 2. 2. 3假單胞菌單獨(dú)降解HPAM研究

挑取一定量經(jīng)活化的假單胞菌CJ419于3(TC條件下在滅菌的實(shí)驗(yàn)廢水樣品中搖瓶 培養(yǎng)25d,定期測(cè)量細(xì)菌生物量的變化；同時(shí)定期檢測(cè)聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度的變化，分 析假單胞菌在不同生長(zhǎng)階段對(duì)HPAM降解的情況。

2. 2. 4枯草芽孢桿菌單獨(dú)降解HPAM研究

挑取一定量經(jīng)活化的枯草芽孢桿菌FA16于3(TC條件下在滅菌的實(shí)驗(yàn)廢水樣品中搖 瓶培養(yǎng)25d,測(cè)量總菌數(shù)的變化；同時(shí)定期檢測(cè)聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度的變化，研究枯草 芽孢桿菌在不同生長(zhǎng)階段對(duì)HPAM降解的情況。

2. 2. 5假單胞菌-枯草芽孢桿菌聯(lián)合降解HPAM研究

挑取一定量活化的假單胞菌CJ419和枯草芽孢桿菌FA16, 30°C條件下1: 1接種于 滅菌的實(shí)驗(yàn)廢水樣品中搖瓶培養(yǎng)25d，測(cè)量各菌菌數(shù)隨時(shí)間的變化；同時(shí)定期檢測(cè)聚丙 烯酰胺質(zhì)量濃度的變化，得到混合菌在不同的生長(zhǎng)階段對(duì)HPAM降解的情況。

使用滅菌的HPAM降解培養(yǎng)基作為降解樣品，平行設(shè)置一組混合菌聯(lián)合降解實(shí)驗(yàn)， 其余條件同上實(shí)驗(yàn)，對(duì)比混合菌在理想和實(shí)際降解環(huán)境下的降解行為差異。

2. 2. 6烴類物質(zhì)總量分析

樣品中的烴類物質(zhì)總量測(cè)定按照中華人民共和國石油天然氣行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SY/T 0530-93《油田污水中含油量測(cè)定方法一一分光光度法》使用722型分光光度計(jì)進(jìn)行。

2. 2. 7混合菌聯(lián)合降解聚丙酰胺機(jī)理研究

對(duì)降解菌各產(chǎn)物的降解能力進(jìn)行測(cè)定。將兩種降解菌分別接種至100mL牛肉膏蛋 白胨培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)48h后分為Al、A2、Bl、B2四份，制備下列降解菌產(chǎn)物。

(1)活菌對(duì)照：兩菌株菌液Al、A2保留作為對(duì)照；

(2)胞外物質(zhì)：菌液Bl、B2于4000r«min-l離心30min取上清液，得到兩菌株的

胞外物質(zhì)Cl，C2;

(3)胞外蛋白產(chǎn)物：菌液Bl、B2于4000 r *111111-1離心30min取上清液。上清液加 入飽和度10%硫酸銨以12000r • min-1離心分離沉淀蛋白后，在原有上清液中繼續(xù)加入 20%、30%直至100%10個(gè)梯度的硫酸銨。收集10% ~ 100%共10個(gè)硫酸銨梯度的全部鹽析 產(chǎn)物，為胞外蛋白產(chǎn)物Bla、B2a;

(4)胞外非蛋白產(chǎn)物：步驟（3)鹽析除去蛋白后的上清液樣品為胞外非蛋白產(chǎn)物 Bib、 B2b;

(5)胞內(nèi)蛋白：步驟（2)離心所獲菌體沉淀經(jīng)磷酸緩沖液沖洗后超聲破碎，12000 r • min-1離心lOmin除去細(xì)胞碎片后得到兩菌株胞內(nèi)蛋白Blc、B2c。

將得到的各組分分為以下幾組：Al，A2, A1+A2, Bla，B2a，Blb，B2b，Bla+B2b， B2a+Blb> Bla+Blb+B2b+B2a > Blc» B2c> Cl» C2> Cl+C2〇

將HPAM模擬水溶液加入以上各類菌液、上清液組分，使溶液最終體積均為100ml。 38°C條件下反應(yīng)72h后，測(cè)定聚合物平均相對(duì)分子量，以判斷各組分降解活性。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

3.1 HPAM自發(fā)降解效果與微生物殘留檢測(cè)

對(duì)照組的滅菌的實(shí)驗(yàn)廢水樣品經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后，樣品中的HPAM表現(xiàn)出了自發(fā)降解 行為，25d之內(nèi)的自發(fā)降解效果如圖3所示。

05112125

時(shí)間T/d

圖3-1對(duì)照組微生物生物量和HPAM自發(fā)降解率 Fig.3-1 Control group microorganism biomass and HPAM spontaneous degeneration rate

滅菌的實(shí)驗(yàn)廢水樣品中3(TC時(shí)HPAM搖瓶自發(fā)降解，25d降解率可達(dá)到7.4%。過 程中未檢測(cè)到微生物殘留。分析在搖瓶培養(yǎng)初期HPAM接觸一定量的氧氣會(huì)導(dǎo)致聚合 物的氧化降解，同時(shí)在搖瓶的過程中HPAM液體與瓶壁摩擦，由于流體流動(dòng)過程中的 剪切作用，使HPAM發(fā)生機(jī)械降解，分子量降低。

3. 2假單胞菌單獨(dú)降解HPAM效果分析

假單胞菌CJ419于30°C培養(yǎng)條件下在滅菌的實(shí)驗(yàn)廢水樣品中搖瓶培養(yǎng)25d,菌株的 生長(zhǎng)情況與HPAM降解的結(jié)果如圖4所示。

圖3-2假單胞菌生長(zhǎng)及HPAM降解相關(guān)圖 Fig.3-2 Pseudomonas Migula growth and degradation of the relevant plans HPAM

細(xì)菌經(jīng)過短暫的遲滯期后迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第4d生長(zhǎng)量達(dá)到最大值106個(gè)，4d 后細(xì)菌生長(zhǎng)曲線回落，因?yàn)轶w系中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及與細(xì)菌生長(zhǎng)密切相關(guān)的離子等物質(zhì)因菌 體大量生長(zhǎng)迅速減少，導(dǎo)致菌體死亡。6d達(dá)到穩(wěn)定，進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維 持細(xì)菌生長(zhǎng)死亡的平衡。穩(wěn)定后維持在104個(gè)左右，而對(duì)HPAM的降解率隨著菌體生長(zhǎng) 快速上升，最大可以達(dá)到30.4%。降解率和菌體量并不完全正相關(guān)，降解菌的降解能力研究和降解機(jī)理初探，隨著菌體量的下降， 降解率還能保持相對(duì)穩(wěn)定。假單胞菌在降解過程中一方面加快聚合物酰胺基水解，增加 聚合物鏈、聚合物分子間的排斥力，另一方面以聚合物為營(yíng)養(yǎng)源，分泌降解酶破壞聚合. 物結(jié)構(gòu)，使鏈分解。

3. 3枯草芽孢桿菌單獨(dú)降解HPAM效果分析

枯草芽孢桿菌30°C條件下在滅菌的實(shí)驗(yàn)廢水樣品中搖瓶培養(yǎng)25d,菌株的生長(zhǎng)情況 與HPAM降解的結(jié)果如圖5所示。

024611162125

時(shí)間T/d

圖3-3枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)及HPAM降解相關(guān)圖 Fig.3-3 Bacillus subtilis growth and degradation of the relevant plans HPAM

枯草芽孢桿菌FA16接種到廢水樣品中后經(jīng)過短暫延滯期后旺盛生長(zhǎng)，對(duì)數(shù)期持續(xù) 6d，最大菌量達(dá)到106個(gè)。lid達(dá)到穩(wěn)定期，HPAM降解率隨之上升，對(duì)HPAM的降解 率最大達(dá)到25.0%。分析枯草芽孢桿菌首先向胞外分泌各種水解酶類，分解酶再將高分 子鏈分解成低分子鏈或使其側(cè)鏈基團(tuán)脫落。酶對(duì)高分子鏈的鏈端進(jìn)行攻擊，而鏈端常埋 藏于聚合物分子線團(tuán)之中，分解酶只能緩慢地接近作用，所以HPAM降解率上升緩慢。

3. 4假單胞菌-枯草芽孢桿菌聯(lián)合降解HPAM效果研究

挑取的假單胞菌和枯草芽孢桿菌1: 1接種于滅菌的實(shí)驗(yàn)廢水樣品中搖瓶共培養(yǎng) 25d,各個(gè)菌株的生長(zhǎng)情況與HPAM降解的結(jié)果如圖6所示。

兩種菌共同接入滅菌的廢水樣品培養(yǎng)基后，表現(xiàn)為兩種菌生長(zhǎng)遲滯期都相對(duì)延長(zhǎng)， 其中假單胞菌初期生長(zhǎng)相對(duì)迅速，4d可達(dá)到最大值，但是生物量與假單胞菌單獨(dú)降解 HPAM時(shí)有明顯的下降，最大菌數(shù)達(dá)105個(gè)?？莶菅挎邨U菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期推遲，在假單胞 菌進(jìn)入衰亡期時(shí)枯草芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，lid時(shí)最大菌數(shù)達(dá)到107個(gè)。

HPAM的降解出現(xiàn)兩個(gè)峰值，假單胞菌首先生長(zhǎng)降解HPAM，第5d降解率達(dá)到 35.6%，5d后假單胞菌與枯草芽孢桿菌共同生長(zhǎng)作用降解聚合物，21d對(duì)HPAM降解率 達(dá)到80.3%。

混合菌進(jìn)入系統(tǒng)后假單胞菌首先適應(yīng)環(huán)境快速生長(zhǎng)，HPAM初步降解，產(chǎn)生小分子 降解產(chǎn)物。假單胞菌利用小分子物質(zhì)生長(zhǎng)繁殖，釋放各種胞外物質(zhì)促進(jìn)HPAM的進(jìn)一 步降解，降解的結(jié)果又為假單胞菌的生長(zhǎng)繁殖提供更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。假單胞菌對(duì)數(shù)期生 長(zhǎng)期間，抑制枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)。當(dāng)假單胞菌進(jìn)入衰亡期時(shí)枯草芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期，一方面是因?yàn)榧賳伟罅克劳?，枯草芽孢桿菌利用HPAM部分降解產(chǎn)物與細(xì) 胞破碎釋放的胞內(nèi)物質(zhì)大量繁殖；另一方面，圖6顯示枯草芽孢桿菌生物量與單獨(dú)生長(zhǎng) 時(shí)相比有明顯增加，證明了假單胞菌分泌的代謝產(chǎn)物對(duì)其生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

為了考察混合菌株在理想狀態(tài)下單獨(dú)對(duì)HPAM的降解行為，特設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)組使 用HPAM降解培養(yǎng)基作為降解樣品，對(duì)聯(lián)合降解效果在無雜質(zhì)干擾的情況下進(jìn)行了考

察。平行實(shí)驗(yàn)組中混合菌對(duì)HPAM的降解效果和混合菌生長(zhǎng)情況如圖7所示。

圖3-5 HPAM降解培養(yǎng)基中混合菌生長(zhǎng)及HPAM降解相關(guān)圖 Fig J-5 Mixed bacteria growth and degradation of the relevant plans HPAM degeneration culture

medium

聯(lián)合降解25d后，假單胞菌4d最大菌數(shù)達(dá)105個(gè)左右。枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)lid時(shí)最 大菌數(shù)在106-107個(gè)之間，HPAM的降解率達(dá)到79.7%。圖7中菌株聯(lián)合降解行為與圖6 中降解曲線趨勢(shì)基本相同，這個(gè)結(jié)果可以表明混合菌株在廢水樣品和理想狀態(tài)下的降解 行為無明顯差異，包括烴類物質(zhì)在內(nèi)的其它廢水中成分對(duì)于菌株對(duì)HPAM的降解效果 無明顯影響。

3. 5兩株菌降解HPAM的機(jī)理研究

測(cè)定降解菌發(fā)酵液各組成部分對(duì)聚合物的作用效果，結(jié)果見表1。兩種菌的胞外物 質(zhì)對(duì)HPAM的降解效果較好，降解后HPAM分子量分別降至7.0X106和8.3X106,而胞內(nèi) 蛋白基本沒有作用。

表3-2假單胞菌(A1)和枯草芽孢桿菌(A2)各組分對(duì)HPAM的降解效果 Table 3-2 Pseudomonas migula and Bacillus subtilis (A2)of each component of the degradation

effect of HPAM

實(shí)驗(yàn)

前細(xì)菌菌

液胞外蚩白產(chǎn) 物胞外非蛋白 產(chǎn)物胞外物

質(zhì)胞內(nèi)蛋白

A1 A2BlaB2aBibB2bC1C2BlcB2c

PH7.46.3 6.56.66.57.17.26.46.37.37.4

HPAM相對(duì)分子質(zhì) 量(xl〇6)MW18.24.7 6.117.517.215.816.47.08.317.917.8

HPAM溶解在水中時(shí)，HPAM的側(cè)鏈基團(tuán)主要為-CONH2和-C00-,在微生物的作 用下，降解菌的降解能力研究和降解機(jī)理初探，一部分-(：0>1112基團(tuán)被微生物分泌的胞外蛋白水解為-COOH和-NH3,氨基被微 生物吸收為氮源供微生物生長(zhǎng)所需，而-COOH進(jìn)一步電離為-C00-和H+，使pH降低。 同時(shí)可以看出細(xì)菌菌液同胞外無菌體物質(zhì)的降解能力相當(dāng)，而胞內(nèi)蛋白對(duì)HPAM基本 沒有降解作用，這證明細(xì)菌降解HPAM是通過分解胞外物質(zhì)的方式進(jìn)行的，而無法將 聚合物包裹或吸收到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行降解。從胞外蛋白產(chǎn)物和胞外物質(zhì)的降解能力得出，細(xì) 菌胞外分泌的蛋白不能明顯降低聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量，降解需要胞外非蛋白產(chǎn)物的共 同參與才能完成。當(dāng)兩菌株混合進(jìn)行降解時(shí)，會(huì)大大提高降解效果，菌體間協(xié)同作用表 現(xiàn)明顯，所以進(jìn)一步考察兩菌株協(xié)同作用下聚合物的降解機(jī)理。

對(duì)兩菌株不同胞外蛋白及非蛋白組分組合結(jié)果如表2。

表3-3兩菌株組分混合對(duì)HPAM的降解效果 Table 3-3 Effects of two strains on degradation of HPAM

實(shí)驗(yàn)前A1+A2C1+C2Bla+B2bB2a+Blb

PH7.46.16.26.46.6

HPAM相對(duì)分子質(zhì)量（X 106) MW18.23.28.18.27.9

由表2得出結(jié)論，兩菌混合協(xié)同降解時(shí)降解能力明顯提高，聚合物相對(duì)分子質(zhì)量明 顯下降，而對(duì)兩種菌不同的胞外蛋白和非蛋白物質(zhì)組合可以看出，兩種菌的降解效果相 當(dāng)，說明胞外還原酶類的酶解作用和非蛋白物質(zhì)沒有相關(guān)性，非蛋白物質(zhì)中一部分為還 原性物質(zhì)，與HPAM自動(dòng)氧化產(chǎn)生的初級(jí)自由基反應(yīng)，引發(fā)連鎖自動(dòng)氧化反應(yīng)，使HPAM 的C-C鍵斷裂，形成短鏈聚合物。有菌體的降解組（A1+A2)降解效果明顯高于只有胞 外物質(zhì)的降解組（C1+C2)。菌液與胞外物質(zhì)的共同降解實(shí)驗(yàn)說明，微生物對(duì)聚合物的 降解作用主要由胞外酶進(jìn)行，但微生物體本身也參與了聚合物的降解作用。首先通過胞 外酶的作用，聚合物被降解成小分子物質(zhì)，降低了分子量，從而被微生物進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)

化降解，同時(shí)生長(zhǎng)迅速的菌體又產(chǎn)生大量的胞外物質(zhì)促進(jìn)HPAM的降解作用。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)聯(lián)合降解過程中廢水樣品中烴類物質(zhì)含量進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)分析，25d之 內(nèi)的烴類總量變化結(jié)果如圖8所示。

12 r

28 6 4

Q IIIII1I

051015202530

時(shí)間/d

圖3*6混合菌降解廢水樣品中烴類物質(zhì)的降解率 Fig.3-6 Mix fungus degeneration waste water culture medium petroleum degeneration rate

混合菌聯(lián)合降解25d后，烴類物質(zhì)質(zhì)量濃度由降解前的9.6mg/L降至6.2mg/L。分 析微生物在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生表面活性劑，通過乳化作用增加烴類化合物的溶解度。在 HPAM降解過程中生長(zhǎng)旺盛的菌體在細(xì)微油滴周圍形成局部的過飽和態(tài)，從而使烴類物 質(zhì)與微生物細(xì)胞有效接觸而被利用，被分解的烴類物質(zhì)為微生物生長(zhǎng)提供了碳源。廢水 培養(yǎng)基中烴類物質(zhì)質(zhì)量濃度很低（烴類物質(zhì)總量質(zhì)量濃度<l〇mg/L),而混合菌株對(duì)烴類 物質(zhì)有一定程度的降解作用但并不十分顯著，因此烴類物質(zhì)的降解對(duì)聯(lián)合降解過程沒有 明顯的影響。，

4小結(jié)

(1)對(duì)HPAM在3(TC條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，25d之內(nèi)的自發(fā)降解降解率可達(dá)到7.4%。

(2) 假單胞菌CJ419于3(TC條件下?lián)u瓶培養(yǎng)25d,細(xì)菌第4d生長(zhǎng)量達(dá)到最大值 106個(gè)，對(duì)HPAM降解率可達(dá)30.4%。

(3)枯草芽孢桿菌FA16 30°C條件下在滅菌的實(shí)驗(yàn)廢水樣品中搖瓶培養(yǎng)25d,對(duì)數(shù)

期持續(xù)6d，最大菌量達(dá)到106個(gè)。對(duì)HPAM的降解率最大達(dá)到25.0%并穩(wěn)定在24%左右。

(4)挑取的假單胞菌和枯草芽孢桿菌1: 1接種于滅菌的實(shí)驗(yàn)廢水樣品中搖瓶共培 養(yǎng)25d，假單胞菌初期生長(zhǎng)相對(duì)迅速，4d可達(dá)到最大值，最大菌數(shù)達(dá)105個(gè)。枯草芽孢 桿菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期推遲，在假單胞菌進(jìn)入衰亡期時(shí)枯草芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，lid時(shí)最 大菌數(shù)達(dá)到107個(gè)。HPAM的降解出現(xiàn)兩個(gè)峰值，假單胞菌首先生長(zhǎng)降解HPAM，第5d 降解率達(dá)到35.6%, 5d后假單胞菌與枯草芽孢桿菌共同生長(zhǎng)作用降解聚合物，降解菌的降解能力研究和降解機(jī)理初探，21d對(duì) HPAM降解率達(dá)到80.3%。

(5)推測(cè)復(fù)合菌共同作用機(jī)理是.•假單胞菌首先優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，通過胞外酶和胞外還 原性物質(zhì)部分分解HPAM，形成的小分子降解產(chǎn)物，為枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)提供了營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)。此時(shí)短鏈HPAM結(jié)構(gòu)松散，鏈端從聚合物中露出，枯草芽孢桿菌分泌胞外酶更容 易攻擊鏈端導(dǎo)致HPAM進(jìn)一步分解。同時(shí)混合菌產(chǎn)生多種胞外非蛋白物質(zhì)與胞外酶系 協(xié)同作用，使后期降解效果大大提高。

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