聚合物降解菌的分離篩選及鑒定，聚丙烯酰胺是一種高分子量的聚合物，常規(guī)菌種降解難度很大。本研究通過采自聚 合物含量高的陜北油田地區(qū)的泥漿池廢液和周邊土壤中的樣品，分離篩選對(duì)聚丙烯酰胺 環(huán)境有高度適應(yīng)能力和對(duì)聚合物有降解潛力的菌株，并對(duì)最終得到目標(biāo)菌種進(jìn)行分離鑒 定。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1菌種來源

菌種由陜西長慶43-1號(hào)油田泥漿池廢液和4-23號(hào)油田廢棄泥漿池周圍土壤中分別分

離篩選得到。 1.2主要試劑與儀器

主要試劑列表如下:

表2-1主要實(shí)驗(yàn)試劑 Table2-1 Main Reagents

試劑名稱生產(chǎn)公司

蛋白酶K西安潤德生物技術(shù)有限公司

RNaseA西安潤德生物技術(shù)有限公司

三（羥甲基）胺基甲烷（Tris)西安市雁塔區(qū)保昕化學(xué)試劑有限公司

十六烷基三甲基溴化胺（CTAB)陜西昕泰生物科技發(fā)展有限公司

十二烷基硫酸鈉（SDS)西安潤德生物技術(shù)有限公司

聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP)西安永屹生物技術(shù)有限公司

Tris飽和酚上海索萊寶生物科技有限公司

溴化乙錠i：EB)西安國安生物科技有限公司

其它試劑：氯化鈉、乙酸鈉、EDTA、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇等，均為分析 純。

主要儀器列表如下:

表2-2主要實(shí)驗(yàn)儀器 Table2-2 Main experimental apparatus

儀器名稱生產(chǎn)公司

SartoriusBS210S 電子天平北尕賽文利斯天平有限公司

Eclipse E200 顯微鏡曰本尼康公司

顯微攝像系統(tǒng)日本尼康公司

LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠

GZX-DH400-BS-II電熱恒溫干燥箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠

SXK-103超凈工作臺(tái)安徽蚌埠凈化設(shè)備廠

DNP-9052細(xì)菌培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠

ZHWY-A211C臥式旋轉(zhuǎn)型搖床上海智城分析儀器制造有限公司

SPX-250IC人工氣候箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司

PYX-DHS-35X40隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠

手持式土壤PH測試儀廣州銘睿電子土壤酸度計(jì)

土壤水份測定伩哈爾濱宇達(dá)電子技術(shù)有限公司銷售部

1.3培養(yǎng)基

菌種篩選培養(yǎng)基。其組成如下：乳酸鈉4ml，KH2P040.02g，聚合物降解菌的分離篩選及鑒定，NaCl 10g, MgS04 *7^0 為0.2g,維生素C0.2g，酵母膏l(xiāng).Og,模擬水為1000ml的lg/LHPAM。滅菌冷卻后加 入經(jīng)紫外滅菌的FeS04(NH4)2S04 • 6H20。

實(shí)驗(yàn)用部分水解聚丙烯酰胺分子量1.7-2.2X107,水解度18.6-29.3%,高效pH范圍 4-13,固含量之90%,殘單0.05-0.15%,白色顆粒粉末，由鞏義市拓普凈水材料有限公司 提供。

富集培養(yǎng)基：在菌種篩選培養(yǎng)基中分別加0.1%酵母膏和0.1%蛋白胨，用于菌株的 平板培養(yǎng)和斜面保存。

細(xì)菌分離及斜面培養(yǎng)基：蛋白胨l〇g，牛肉膏4.5g,氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水 lOOOmL, pH 值 7.2?7.5。

真菌分離及斜面培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯200g煮出液，蔗糖20g，瓊脂15?20g， 蒸餾水1000 mL, pH值自然。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1菌株的富集

實(shí)驗(yàn)樣品采自陜西長慶43-1號(hào)油田泥漿池廢液周圍土壤和4-23號(hào)油田廢棄泥漿池 周圍土壤的共4處采樣點(diǎn)。采樣方法：用小鐵鍬除去地面浮土后，取地表或地下10 cm 的土壤樣品，置于-2(TC保存。

表2-3采集土壤特性

Table2-3 Collected soil characteristics

編號(hào)PH含水率

43-1號(hào)采樣點(diǎn)18.558.3%

43-1號(hào)采樣點(diǎn)28.898.5%

4-23號(hào)采樣點(diǎn)18.3715.1%

4-23號(hào)采樣點(diǎn)28.2115.6%

將所采集的HPAM污染土樣稱量10g,接入200mL已滅菌的富集液體培養(yǎng)基中， 在30°C旋轉(zhuǎn)式搖床中(轉(zhuǎn)速200 r/min)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)4d后，移取一定量含菌的富集培養(yǎng)液接 入新鮮滅菌過的富集培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)4d，一共重復(fù)3次，得到富集的HPAM 降解混合菌。

2. 2菌株的篩選

取O.lmL菌液涂布于以HPAM為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)48h，待平板 長出菌落后選擇生長良好且性狀差異明顯的菌落，連續(xù)平板劃線純化，將純化的菌株轉(zhuǎn) 接于篩選養(yǎng)基斜面培養(yǎng)Id后4"C保存于冰箱。

2. 3形態(tài)鑒定

根據(jù)《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》（Buchanan R.E. and Bergey N.E., 1994)和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001)的方法，進(jìn)行各菌株 的形態(tài)鑒定，包括細(xì)菌個(gè)體形態(tài)觀察(革蘭氏染色、芽孢染色和菌體大小等)和菌落形態(tài) 觀察(菌落形態(tài)、菌落質(zhì)地、菌落邊緣、光學(xué)特性和菌落的顏色等)。

2. 4菌株的常規(guī)生理生化性質(zhì)測定

挑取篩選到的菌株分別接入篩選養(yǎng)基中，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速200 r/min的旋轉(zhuǎn)式搖 床中搖瓶培養(yǎng)4d后，將得到的菌液在篩選養(yǎng)基平板上劃線，并在30°C的細(xì)菌培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)活化l-2d。選擇活化良好的菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株，參照《簡明第八版伯杰細(xì)菌鑒定手 冊(cè)》[48]《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[49]對(duì)篩選的細(xì)菌進(jìn)行生理生化性質(zhì)測定，將細(xì)菌初步 鑒定到屬。鑒定方法主要有革蘭氏染色法、芽孢染色法、V-P實(shí)驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí) 驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、明膠液化、半固體瓊脂穿刺、細(xì)菌的運(yùn) 動(dòng)性觀察、硫化氫反應(yīng)等，各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：

(1)革蘭氏染色：挑取少量菌苔涂布在載玻片上，風(fēng)千，在火焰上固定涂片，滴加結(jié) 晶紫染色1-2 min，水洗，滴加碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1 min,水洗。用濾紙吸 去載玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇 無紫色時(shí)，立即水洗。用番紅液復(fù)染約2 min,水洗。干燥后，用油鏡觀察。菌體被染 成藍(lán)紫色的為革蘭氏陽性菌，被染成紅色的為革蘭氏陰性菌。

(2)芽孢染色：加1-2滴水于小試管中，用接種環(huán)挑取2-3環(huán)菌苔于試管中，攪拌均勻， 制成濃的菌懸液。加孔雀綠染液2-3滴于小試管中，并使其與菌液混合均勻，然后將試 管置于沸水浴的燒杯中，加熱染色15-20 min。用接種環(huán)挑取試管底部菌液數(shù)環(huán)于潔凈 載玻片上，涂成薄膜，然后將涂片通過火焰3次溫?zé)峁潭?。水洗，直至流出的水無綠色 為止。用番紅染液染色2-3 min，傾去染液并用濾紙吸干殘液。干燥后用油鏡觀察。芽 孢呈綠色，芽孢囊及營養(yǎng)體為紅色。

(3)尿素酶（Urease)試驗(yàn)：挑取培養(yǎng)了 18~24h的待試菌培養(yǎng)物接種于液體培養(yǎng)基管 中，搖均，于36°C各培養(yǎng)lOmin，60min和120min，分別觀察結(jié)果。若結(jié)果為粉紅色為、 則呈陽性。

(4)氧化酶（Oxidase)試驗(yàn)：在瓊脂斜面上滴加試劑1?2滴，數(shù)分鐘內(nèi)直接觀察結(jié)果。 使用Kovacs氏試劑陽性者呈粉紅色或深紫色，Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。

(5)過氧化氫酶的測定：將測試菌種接種于合適的培養(yǎng)基斜面上，適溫培養(yǎng)18?24h。 取一干凈的載波片，在上面滴1滴3?10%的H202,挑取1環(huán)培養(yǎng)了 18?24h的菌苔純培 養(yǎng)，在H202溶液中涂抹，若有氣泡出現(xiàn)，則為過氧化氫酶陽性，無氣泡者為陰性。

(6)甲基紅（Methyl Red)試驗(yàn)：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于MR-VP生化 鑒定管，在通用培養(yǎng)基30°C下培養(yǎng)3?5天，從第二天起，每日取培養(yǎng)液lml,加入甲基 紅指示劑1?2滴，觀察結(jié)果。陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。從發(fā)現(xiàn)陽 性開始到第5天仍為陰性的，即可判定結(jié)果。

(7)V-P試驗(yàn)：將實(shí)驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基于36°C培養(yǎng)48h,培養(yǎng)液lml加O’Meara 試劑lml，搖動(dòng)試管1?2min,靜置于36°C恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅的紅色即判定為 陰性，聚合物降解菌的分離篩選及鑒定，反之為陽性。

(8)葡萄糖的氧化發(fā)酵試驗(yàn)：以培養(yǎng)18?24h的幼齡菌種，穿刺接種在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中， 每株菌接4管，其中2管用油封蓋，以隔絕空氣閉管。另2管不封油為開管，同時(shí)留有 不接種的閉管作為對(duì)照。適溫培養(yǎng)1、2、4、7天觀察結(jié)果。氧化型產(chǎn)酸：僅開管產(chǎn)酸。 發(fā)酵型產(chǎn)酸：開管及閉管均產(chǎn)酸。如產(chǎn)氣，則在瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡。

(9)硝酸鹽（Nitrate)還原試驗(yàn)：臨試前將試劑磺胺酸冰醋酸溶液和試液a —萘胺乙醇 溶液各0.2ml等量混合，取混合試劑約0.1ml，加于液體培養(yǎng)基或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面， 立即或于lOmin內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗(yàn)陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。

(10)靛基質(zhì)（Imdole)試驗(yàn)：將待測菌種接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管，于36°C培養(yǎng)24h時(shí)后， 先加少量乙醚或二甲苯，搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿 試管壁徐徐加入Kovacs氏試劑數(shù)滴，觀察結(jié)果。若在試劑和培養(yǎng)基接觸面上呈紅色， 即為陽性。

(11)三糖鐵（TSI)瓊脂試驗(yàn)：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種 并涂布于斜面，置36°C培養(yǎng)18?24h，觀察結(jié)果。

(12)氨基酸脫羧酶的測定：用幼齡培養(yǎng)液作為菌種，直接接種。接種后封油，對(duì)照管 與測定管同時(shí)接種封油。腸肝菌科的細(xì)菌于37°C培養(yǎng)4天觀察。當(dāng)指示劑呈紫色或帶紅 色調(diào)的紫色者為陽性，呈黃色者為陰性。對(duì)照管應(yīng)呈黃色反應(yīng)。

(13)硫化氫（H2S)試驗(yàn).•在含有硫代硫酸鈉指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種于 36C培養(yǎng)24~28h,培養(yǎng)基呈黑色為陽性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天再觀察結(jié)果。

(14)檸檬酸鹽或丙酸鹽的利用：取幼齡菌種接種于斜面上，適溫培養(yǎng)3?7天，培養(yǎng)基 呈堿性（藍(lán)色）者為陽性反應(yīng)，不變者則為陰性。

(15)葡萄糖酸鹽的氧化：用pH7.2的磷酸緩沖液配制成含1%葡萄糖酸鹽的溶液，分 裝試管，每管2mL。挑取30°C溫培養(yǎng)的18~24h的菌落至2mL的葡萄糖酸鹽溶液中制 成濃的菌懸液，置30°C過夜。每管加入0.5mL的斐林試劑，放在沸水浴中加熱10分鐘, 觀察結(jié)果。試管中液體由藍(lán)色變?yōu)辄S綠，綠橙色或出現(xiàn)紅色沉淀者為陽性反應(yīng)，如溶液 不變色者為陰性。

(16)耐鹽性試驗(yàn)：以肉湯培養(yǎng)液根據(jù)鑒定需要，配成不同濃度的NaCl，如2%、3.5%、 5%、7%、10%等。培養(yǎng)基要求十分澄清，接種時(shí)應(yīng)采用幼齡菌液，直針接種，適溫培 養(yǎng)3?7d，與未接種的對(duì)照管對(duì)比，目測生長情況。

(17)酪素水解試驗(yàn)（酪蛋白水解)：取5g脫脂奶粉加入50mL蒸餾水中，稱1.5g瓊脂 溶于50mL蒸餾水中，將兩液分開滅菌。稍冷卻后將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。 將平板倒置過夜后將菌種點(diǎn)接在平板上。適溫培養(yǎng)1、3、5天，觀察結(jié)果，記錄菌落周

圍和下面酪素是否已被分解而呈透明。

(18)苯丙氨酸脫氨試驗(yàn)：將菌種接種于該培養(yǎng)基斜面上，30°C下溫培養(yǎng)3?7d。取10% 的FeCl3水溶液4滴，滴加在生長菌苔的斜面上，當(dāng)斜面和試劑液面處呈藍(lán)綠色時(shí)則為 陽性反應(yīng)。

(19)產(chǎn)糊精結(jié)晶試驗(yàn)：在大試管中裝碾過的小麥0.5g，碳酸鈣0.2g, H20 10mL,滅 菌后接種，35°C培養(yǎng)3d、5d和7d后，取1滴盧哥爾氏捵液混勻，干燥后，用顯微鏡觀 察有暗褐色或藍(lán)色的六角形結(jié)晶的糊精，假若大量形成，則排列為扇形或針狀。

(20)在pH5.7營養(yǎng)肉湯上的生長：取菌液一環(huán)，接種于上述培養(yǎng)基中，同時(shí)接種普通 肉湯液（7.2pH)作對(duì)照。適溫培養(yǎng)1?3d后觀察生長情況。

(21)需氧性試驗(yàn)：用接種環(huán)挑取一環(huán)肉湯菌液，穿刺接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)， 在3至7天觀察結(jié)果。如細(xì)菌在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌，如沿著穿刺線上生長者 為厭氧菌或兼性厭氧菌。

(22)淀粉水解試驗(yàn)：待測菌種培養(yǎng)18?24h得到純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂平板， 于36°C培養(yǎng)24~48h，然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，立即檢視結(jié)果，陽性反應(yīng)時(shí) 淀粉被分解，瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無 變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。

(23)生長溫度的測定：放置于恒溫水浴培養(yǎng)。聚合物降解菌的分離篩選及鑒定，指示溫度計(jì)應(yīng)放在同樣的試管和培養(yǎng)基 內(nèi)，在指定溫度下培養(yǎng)2?5d，觀察生長情況。在接近0°C的低溫培養(yǎng)，則觀察時(shí)間可延 長至7~10山甚至30d#目測生長情況，與未接種的空白培養(yǎng)基對(duì)比，注意混濁度、沉 淀物和懸浮物等項(xiàng)。

(24)形成芽孢的培養(yǎng)基形成芽孢是芽孢桿菌的關(guān)鍵性特征，但不是所有的芽孢桿菌都 能在任何條件下形成芽孢。在鑒定細(xì)菌時(shí)，為了確定是否屬芽孢菌，需要對(duì)那些在一般 條件下不形成芽孢的細(xì)菌，采用生孢子培養(yǎng)基，來確定是否能形成芽孢。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

3.1菌株的分離篩選形態(tài)鑒定結(jié)果

經(jīng)過富集培養(yǎng)基富集，對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行分離、純化，共得到2株具有降解HPAM潛 能的菌株。

陜西長慶43-1號(hào)油田泥漿池廢液中分離的菌種如圖1所示，命名為CJ419。革蘭氏 染色為陰性，菌株細(xì)胞呈小桿狀，可運(yùn)動(dòng)；在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上為乳白色菌落，光 滑。

4*23號(hào)油田泥漿池廢液中富集分離的菌種如圖2所示，命名為FA16。革蘭氏染色為 陽性，菌體為短桿狀，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上為白色菌落，菌落不規(guī)則生長、表面有

褶皺.

3. 2面株的生理生化性質(zhì)鑒定結(jié)果

依據(jù)《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》和 < 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》, 對(duì)菌株CJ419和FA16的分別進(jìn)行吲哚試驗(yàn)、接觸酶反應(yīng)等生理生化特征鑒定，結(jié)果見 表24。

表24拮抗菌株CJ419和FA16生理生化特征 Table 2-4 Antagonistic strains CJ419 and FA16 physiological and biochemical characteristics

項(xiàng)目菌株CJ419項(xiàng)目菌株FA16

嚴(yán)格好氧+鞭毛數(shù)>1

過氧化氫酶+熒光色素-

硝酸鹽還原+在4。<：生長+

淀粉水解+在41°C生長-

吲哚產(chǎn)生-從蔗糖產(chǎn)生果聚糖+

H2S產(chǎn)生-精氨酸雙水解酶+

酪素水解+氧化酶反應(yīng)+

檸檬酸鹽利用+反硝化+

pH5.7營養(yǎng)肉湯+明膠水解+

V.P試驗(yàn)+淀粉水解■

溫度45 °C+葡萄糖

利用+

溫度65 °C■海藻糖+

葡萄糖產(chǎn)酸+L-脯氨酸+

乳糖產(chǎn)酸6•苯丙氨酸+

甘露醇產(chǎn)酸 葡萄糖產(chǎn)氣 10%NaCl+

+DL-精氨酸+

由表2>4可知，菌株FA16的生理生化特征與假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株保持一致。通過查閱 《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，聚合物降解菌的分離篩選及鑒定，綜合菌 株形態(tài)特征和生理生化特征，可初步確定菌株屬于假單胞菌

菌株CJ419的生理生化特征與枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株保持一致。綜合菌株形態(tài)特征 和生理生化特征，通過查閱相關(guān)鑒定手冊(cè)，可初步確定菌株屬于芽孢桿菌(Bacillus spp.)。

4小結(jié)

(1)從聚合物含量很高的陜西長慶43-1號(hào)油田泥漿池廢液和4-23號(hào)油田廢棄泥漿 池周圍土壤中采樣，將所采集的HPAM污染土樣富集培養(yǎng)基，連續(xù)傳代得到富集的 HPAM降解混合菌。取菌液涂布于以HPAM為唯一碳源的篩選養(yǎng)基上，選擇生長良好 的性狀差異明顯的菌落，連續(xù)平板劃線純化，通過對(duì)樣品的篩選得到對(duì)聚丙烯酰胺有高 度適應(yīng)能力和降解能力的兩株菌株，分別命名為CJ419和FA16。

(2)對(duì)兩菌株進(jìn)行宏觀形態(tài)和顯微鑒定、生理生化鑒定，依據(jù)《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，最終初步確定CJ419為假單 胞菌FA16 為枯草芽孢桿菌 。

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