聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟:
聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟作為檢測(cè)DNA序列差異的有效手段，變性凝膠電泳在我室廣泛使用，但是也有其使用范圍。在我室還有一種常用的非變性凝膠電泳技術(shù)，簡(jiǎn)稱SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism，單鏈構(gòu)象多態(tài)性）。
聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟原理：在SSCP測(cè)定中，雙鏈DNA（dsDNA）被變性成為單鏈DNA（ssDNA），每一條單鏈DNA都基于它們的內(nèi)部序列而呈現(xiàn)出一種獨(dú)有的折疊構(gòu)象，即使同樣長(zhǎng)度的DNA單鏈因其堿基順序不同、甚至單個(gè)堿基的不同會(huì)形成不同的構(gòu)象。這些單鏈DNA在非變性條件下，用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，單鏈DNA的遷移率和帶型，都取決于其折疊構(gòu)象和電泳時(shí)的溫度。
SSCP與變性凝膠電泳基本一致，聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟不同之處有以下幾點(diǎn)：
a． SSCP使用非變性凝膠進(jìn)行電泳，即在凝膠配制中不加入變性劑。我室常用8%非變性膠（丙烯酰胺 80g，N- N，-亞甲雙丙烯酰胺 2.76 g，10×TBE 50ml，加水定容到1L）
b． 工作環(huán)境，由于SSCP受溫度影響，所以在電泳過程中應(yīng)防止溫度的升高，所以電泳環(huán)境為電壓400V，電流50mA，單板電泳功率為9W，不用預(yù)熱。緩沖液最好用新配制的。
c． 由于電泳功率較低，所以電泳時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要10小時(shí)以上，因此一般電泳需要過夜。室溫在25。C以下。
1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟
聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量的蛋白質(zhì)，小于1kb的DNA片段和DNA序列。分析裝載的樣品容量大，可回收，DNA純度高。在催化劑TEMED（N-N-N，- N，-四甲基乙二胺）和過硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成長(zhǎng)鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N- N，-亞甲雙丙烯酰胺的參與下，聚丙烯酰胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)結(jié)形成凝膠。
1.1 配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g
N- N，-亞甲雙丙烯酰胺 1g
加水至100ML，40C棕色瓶可保存二月
1.2 配制5×TBE緩沖液：
TRIS堿 54克
硼酸 27.5克
EDTA 3.72克
加水至1L
1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟所用試劑體積
試劑
制備不同濃度聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟（%）凝膠所用試劑體積（ml）
3.5
5.0
8.0
12.0
20.0
30%丙烯酰胺
11.6
16.6
26.6
40.0
66.6
水
67.7
62.7
52.7
39.3
12.7
5×TBE
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
10%過硫酸銨
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
1.4 DNA在聚丙烯酰胺凝膠中有效分離范圍
丙烯酰胺（%）
有效分離范圍（bp）
二甲苯氰FF
溴酚藍(lán)
3.5
1000-2000
460
100
5.0
80-500
260
65
8.0
60-400
160
45
12.0
40-200
70
20
15.0
25-150
60
15
20.0
6-100
45
12
2. 聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟具體步驟
2.1從NaOH池中撈出浸泡的玻璃板，取出上面的殘膠
2.2 把玻璃板拿到流動(dòng)水處洗刷干凈
2.3 洗干凈的玻璃板至于玻璃板架上晾干
2.4 用乙醇擦洗玻璃板
2.5 帶凹口的背板涂上硅化劑，面板則涂上粘合劑，防止電泳完畢發(fā)生撕膠和脫膠的可能（涂摸要均勻）
2.6 面板在下，背板在上。兩側(cè)用塑料板密封，并用夾子夾好。底部調(diào)節(jié)使之水平
2.7 將加入催化劑后的凝膠沿凹口均勻倒下，插入適當(dāng)?shù)姆鈼l。勿使封條下留下氣泡。用夾子夾緊封條部位
2.8 室溫聚合30分鐘，小心取出凹口處封條，用水沖洗加樣孔（否則封條所殘留的丙烯酰胺在加樣孔聚合產(chǎn)生不規(guī)則表面，引起DNA帶變形）
2.9 將凝膠固定在電泳槽里。帶凹口背板朝里，面向緩沖液槽
2.10 用0. 5×TBE灌滿電泳槽的緩沖液槽，接上電極，打開電源。調(diào)試工作環(huán)境為電壓2000-2200V，電流150-200mA，單板電泳功率為80W。預(yù)熱30分鐘左右。
2.11 點(diǎn)樣之前需切斷電源，用槍將點(diǎn)樣孔的氣泡及膠吹出，然后插入點(diǎn)樣梳，注意不要插得太深，否則點(diǎn)樣膠面會(huì)變形，影響美觀及點(diǎn)樣。
2.12槍吸加樣品，PCR產(chǎn)物先加loading buffer 10ul ,再變性5分鐘左右，接著在冰水中冷卻5分鐘以上方可點(diǎn)樣，點(diǎn)樣完畢，電泳開始。
2.13 電泳至所需位置后，切斷電源，拔出導(dǎo)線，回收緩沖液，卸下玻璃板。在工作臺(tái)上，將背板撬起，放回原處。將面板進(jìn)行銀染
3. 電泳后的銀染檢測(cè)
3.1 原理：
影像產(chǎn)生是由于核酸在膠上所占部位與周圍的氧化——還原勢(shì)不同而產(chǎn)生。銀染液中的銀離子（Ag+）可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，這樣核酸電泳帶就染成了黑褐色。
3.2 銀染
銀染液的配制：稱2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水
銀染:將電泳完的面板首先在銀染漂洗盆了漂洗趕緊，使膠面上沒有異物。玻璃板反面沒有污染物。
將加入銀染液的銀染盆放在搖床上后，將面板放入銀染1小時(shí)左右。
3.3 顯影
顯影液的配制：NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml
顯影：將面板從銀染盆里取出，在銀染漂洗盆里漂洗，震蕩5-6次，取出后使其表面盡量無(wú)水，再放入已加入顯影液的顯影盆里（顯影，顯影液的配制及甲醛的加入都需要在通風(fēng)櫥的搖床上進(jìn)行）顯影過程大約10到15分鐘，以DNA條帶清晰可見為準(zhǔn)。
將顯現(xiàn)完畢的板子在顯影漂洗盆里漂洗后，方可讀帶。
本實(shí)驗(yàn)室凝膠電泳相關(guān)常用試劑配方：
1. 我實(shí)驗(yàn)室常用的聚丙烯酰胺凝膠是6%變性聚丙烯酰胺凝膠（簡(jiǎn)稱變性膠，PAGE），就是在普通聚丙烯酰胺凝膠中加入變性劑。我們使用的變性劑是尿素。
6%PAGE具體配制方法為:
尿素210g，10×TBE 25ml ，丙烯酰胺28.5 g ，亞甲雙丙烯酰胺 1.5g，加水定容至500ml，過濾后使用。
考慮到方便使用的問題，一般一次配制2L（尿素840g，10×TBE100ml，丙烯酰胺114g，亞甲雙丙烯酰胺6g）。
2. 10×TBE（Tris-硼酸-EDTA）的配制
EDTA 7.44g，硼酸55g，Tris 108g，加水定容至1000ml
3. 10%過硫酸氨（AP）
10g過硫酸氨，純水定容至100ml
4. 硅化劑配方
二甲基二氯硅烷：無(wú)水乙醇=13ml：500ml
5. 反硅化劑（粘合劑）配制
無(wú)水乙醇 500ml（一瓶），44ddH2O，3.3冰醋酸，550ul Bind silnce（3，-Trimethoxysilyl propyl）
配置完遮光4。C保存
6 loading buffer 配制
0.1g 二甲苯氰，0.1g 溴酚藍(lán)，1ml 0.5molEDTA ，100mL甲酰胺
實(shí)驗(yàn)試劑：
試劑貯備液：
1、 1mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加蒸餾水配成100ml，pH8.9。
2、 1mol/L HCl48ml，Tris5.98g，TEMED0.46ml，加蒸餾水配成100ml，pH6.7。
3、 Acr28g，Bis0.735g，加蒸餾水配成100ml。
4、 Acr10g，Bis2.5g，加蒸餾水配成100ml。
5、 核黃素4mg，溶于100ml蒸餾水中。
6、 蔗糖40g，加蒸餾水配成100ml。
7、 電極緩沖液：Tris6.06g，甘氨酸28.52g，加蒸餾水配成1000ml，pH8.3，用時(shí)稀釋10倍。
8、 過硫酸銨0.14g，加蒸餾水配成100ml。
9、 溴酚藍(lán)1mg溶于100ml蒸餾水中。
10、 脫色溶液：甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸餾水配成100ml。
11、 蛋白質(zhì)染色液：考瑪斯藍(lán)G─250 200mg，甲醇100ml，冰醋酸20ml，蒸餾水80ml，溶解后混合之。
12、 過氧化物酶染色液：
1) 染色液甲：聯(lián)苯胺─抗壞血酸染色液，染色數(shù)分鐘?？箟难?0.4mg，聯(lián)苯胺溶液20ml（2g聯(lián)苯胺溶于18ml用文火加熱的冰醋酸中，再加蒸餾水72ml），0.6%過氧化氫20ml，蒸餾水60ml。
2) 染色液乙：聯(lián)茴香胺染色液，染色至少1小時(shí)。0.1mol/L醋酸緩沖液，pH5.5（0.82g醋酸鈉溶于80ml蒸餾水中，用醋酸調(diào)節(jié)至pH5.5，定容至100ml）。30%H2O20.25ml溶于50ml蒸餾水中，用時(shí)新鮮配制。鄰聯(lián)茴香胺（o─dianisidine）100mg，溶于100ml醋酸緩沖液(1)中。用時(shí)取溶液（2）5ml，溶液（3）50ml，混合之。
實(shí)驗(yàn)步驟：
凝膠的制備：
1、 清洗干凈兩塊玻璃板，晾干后按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出。
2、 將裝好的玻璃電泳板傾斜成45～60℃角。把玻璃板在灌膠支架上固定好。
3、 分離膠：按1∶3∶8∶水=1∶2∶4∶1的比例，先將貯備液1，3和水放在一小燒杯中，過硫酸銨貯備液放在另一小燒杯中，一起放在真空干燥器中，用真空泵抽氣15分鐘，取出將過硫酸銨溶液并入，用玻棒輕輕攪動(dòng)使之混合，立即注于干潔的玻璃板中。玻璃板垂直放置，用滴管吸取混合液，沿管壁注入，注意不要進(jìn)入氣泡。膠液注到離玻璃板口2cm處，立即在其表面覆蓋少量蒸餾水，靜置1小時(shí)左右，當(dāng)見到水層下面有一清晰的界面時(shí)，則表明膠已聚合凝固，用吸水紙小心吸去上面水層。
4、 濃縮膠：按2∶4∶5∶6=1∶2∶1∶4的比例，同上法制備濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置40分鐘。
電泳步驟：
1、 拔出樣梳后,在上槽內(nèi)加入緩沖液,沒過鋸齒時(shí)可拆去底端的瓊脂糖。
2、 用微量注射器距槽底三分之一處進(jìn)樣,加樣前,樣品在沸水中加熱3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。
3、 電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進(jìn)行電泳，開始電流恒定在10mA，當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為20mA，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí)，停止電泳。
4、 凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色1小時(shí)左右。
5、 脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到區(qū)帶清晰。
6、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
注意事項(xiàng)：
1、 固定玻璃板時(shí)，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板。
2、 凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無(wú)法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡。
3、 水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡。
4、 凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。
5、 樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。
6、 要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出,否則會(huì)影響加樣效果。
7、 注射器不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,在樣下沉?xí)r會(huì)發(fā)生擴(kuò)散。
8、 為避免邊緣效應(yīng),最好選用中部的孔注樣.
9、 剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無(wú)損,染色要充分。
變性:是指蛋白質(zhì)被SDS變性。變性后，不同蛋白質(zhì)的荷質(zhì)比相同，在電泳的涌動(dòng)速度只跟分子量成正相關(guān)。
pAGE：既然濃度已經(jīng)決定了 那么凝膠形成的孔徑也就固定不變了。電泳中大分子跑的慢，小分子跑得快 因此蛋白質(zhì)得以分離。
聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacryamide gel electropHoresis, PAGE)是由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化作用下形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)。在不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳中，凝膠的制作是分層進(jìn)行的，因此凝膠不僅有分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)。和瓊脂糖凝膠相比，聚丙烯酰胺凝膠難于制備和處理。它們的分離范圍較窄。但是它們也有突出的優(yōu)點(diǎn)，由于是不連續(xù)的pH 梯度，故樣品被壓縮成一條狹窄的區(qū)帶，因而增強(qiáng)了分離效果，提高電泳分辨率。尤其對(duì)小DNA 片段的分析(5～500bp)。在這一范圍內(nèi)，僅差1bp 的DNA 分子也能清晰地分開。其次，DNA 純度很高。從聚丙烯酰胺凝膠中得到的DNA 純度很高以致于下步操作不用任何處理。還有，它的負(fù)載容量高。該膠的標(biāo)準(zhǔn)加樣槽中可以加入高達(dá)10mL 的DNA 樣品，而不影響電泳分辨率。多應(yīng)用于分離純化和鑒定大小為5～500bp 的DNA 片段。聚丙烯酰胺凝膠電泳有連續(xù)與不連續(xù)體系兩種，前者指在整個(gè)電泳體系中的緩沖液pH 值和凝膠孔徑大小相同，主要用于核酸分析。后者主要用于蛋白質(zhì)樣品的分離，它除了電泳槽中的緩沖體系和pH 值與凝膠中不同外，凝膠本身也由緩沖體系、pH 值和凝膠孔徑不同的兩種凝膠堆積而成。
聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳是以聚丙烯酰胺凝膠做支持物的一種區(qū)帶電泳，由于此種凝膠具有分子篩的性質(zhì)，所以本法對(duì)樣品的分離作用，不僅決定于樣品中各組分所帶凈電荷的多少，也與分子的大小有關(guān)。其次，聚丙烯酰胺凝膠電泳還有一種獨(dú)特的濃縮效應(yīng)，即在電泳開始階段，由于不連續(xù)pH 梯度的作用，將樣品壓縮成一條狹窄區(qū)帶，從而提高了分離效果。
聚丙烯酰胺凝膠具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，很少帶有離子的側(cè)基，惰性好，電泳時(shí)，電滲作用小，幾乎無(wú)吸附作用，對(duì)熱穩(wěn)定，呈透明狀，易于觀察結(jié)果。
聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Bis)在催化劑的作用下，聚合交聯(lián)而成的含有酰胺基側(cè)鏈的脂肪族大分子化合物。
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